口腔微生物学研究对龋病防治的新视野

口腔微生物学研究对龋病防治的新视野

在过去10年的10年里，通过引入生物化学技术，对导致虫洞的细菌进行了深入的阐释，探索了预防和预防虫洞疾病的新领域。从龋病是细菌感染性疾病的观点出发,本文着重介绍关于龋病病因学中起重要作用的细菌因素方面的研究,附带介绍饮食因素和宿主因素方面的研究概况。1细菌生物膜的应用任何微生物的生存离不开物体表面,在各种物体表面上,大的如岩石、树木,小的如心脏瓣膜、牙龈沟内的表面上皮,都可有细菌附着。这种在物体表面上细菌生存的实体被称为“生物膜”。近十几年来,人工的医疗留置器官如人工瓣膜、人工关节、牙科种植体等日渐广泛地被应用,由此而引起的内源性细菌感染,常因对抗生素不敏感而得不到及时有效地控制。究其原因,存在于留置器官表面上的细菌生物膜的耐药作用不容忽视。因此,从20世纪90年代在医学微生物学领域中开展了对细菌生物膜的广泛研究,发现微生物在环境中存在的方式不是单独的菌细胞浮游状态而是群居的生物膜状态,当环境中营养物质不足时,生物膜更能保护菌细胞的生存。对生物膜结构的研究发现,它有着成层结构,其间有水道和通气道与外界相通,细菌嵌入在由多糖、蛋白质和矿物质组成的基质中,这个结构特征恰与牙菌斑相同,因此口腔微生物学的研究者们确认牙菌斑就是典型的生物膜。对牙菌斑的研究也就是对牙生物膜(dentalbiofilm)或称为牙菌斑生物膜的研究。1.1生态习性生物膜早期认为,牙菌斑的结构是沉积在牙表面而未钙化的细菌团块;近年由于激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)的应用,使人们可看到原位的、未因采集菌斑而受到破坏的牙菌斑生物膜,它们以密集的蘑菇云样的三维立体结构起始于牙釉质表面,其间散布着通道通向口腔和开放的水道内含水流,通道中充满着有细菌产生的多糖——细胞外多糖(EPS),细菌嵌入在由多糖、蛋白质和矿物质组成的基质中。由于细菌是生存于有限的营养环境中,所以它们常处于代谢活动不强的休眠状态中。CLSM镜下的生物膜是立体成层结构,采用对活菌或死菌选择性着色的技术可以对正在生长和代谢生物膜结构进行观察,成层的结构中显示细菌的活性多样化。最有活性的细菌贴附于通道的内侧,位于中间层;底层多为死菌;表层为脱附着的菌细胞。1.2srrna和pcr-dage相结合的菌株多样性分析生物膜成层的结构,造成含氧浓度不同的空间,靠近表层氧浓度高,适于需氧菌生长,愈深入内层氧浓度渐低而适于兼性厌氧菌生长,深入底层氧化还原电势更低,适于绝对厌氧菌生存。成层的结构造成生物膜中细菌组成的多样性。据近年研究报道,牙菌斑生物膜内包涵约1000种细菌,其中由传统的细菌培养技术可培养者不足半数。现代分子生物学技术引导出新的细菌检测和鉴定手段,采用16S核糖体RNA基因的核苷酸序列资料(ribosomalRNAgenes),不仅能鉴别那些未获培养的细菌并可推断其种系发生(phylogeny)。16SrRNA基因是核糖体小亚基的骨架,其编码基因存在于细菌、衣原体、支原体等原核生物的基因组中并执行相同功能,其编码基因由保守区和可变区组成,前者为所有细菌共有,后者有种属特异性,可将两区结合起来用于微生物的分类和鉴定,它有足够的长度(1500bp)而易于排序,对于鉴定细菌和种系发生分析有足够的信息。这个技术使数百种细菌分离物能够较快地被鉴定,有时可达种属水平。现已广泛地应用于牙菌斑生物膜的细菌鉴定和组成分析中。如近年从环境16SrRNA序列分析中出现的TM7组群是龈下菌斑中的优势菌,其种系分类起源于淤泥废水处理系统。随着基因序列分析和基因文库的构建,对未获培养细菌的检测鉴定技术进展迅速,其中变性梯度凝胶电泳(DGGE)在1993年由Muyzcr采用研究菌群结构及其动态变化,使用一对特异性引物聚合酶链反应(PCR)扩增细菌群体的16SrRNA基因,产生出序列不同而长度相同的DNA片段混合物,用DGGE分离此混合物,因不同DNA片段的碱基组成不同,因而变性条件亦不同,所需要的变性剂浓度亦不同,遂在凝胶上呈现不同的条带,每个带条可能代表某个细菌种属。从而可全面地了解生物膜中细菌的多样性。梁景平等采用16SrRNA与PCR-DGGE相结合的方法,从种属水平对不同龋敏感儿童牙菌斑生物膜中菌群进行了分析,其优势菌属为链球菌属(口腔链球菌群、变形链球菌群)、放线菌属,还有噬二氧化碳细胞菌属、伯克菌属、奈瑟菌属、纤毛菌属、嗜血杆菌属、普氏菌属和棒杆菌属,主要致龋菌为变形链球菌与远缘链球菌;无龋儿童牙菌斑生物膜有明显的多样性,轻链球菌(S.mitis)、口腔链球菌(S.oralis)和血链球菌与龋病的发生呈负相关。1.3牙菌斑中的高分子问题研究表明,牙菌斑生物膜不是一个某些细菌随意生存的混合体,首先它们有一个共同的特性——黏附于釉质表面薄膜上,然后是它们之间的协同或拮抗作用,保障了它们在生物膜中组成群居的社会。许多细菌共同栖息在一个牙生物膜中,是遵循“生态连续”的原则有序的定植过程:(1)牙表面清洁后,牙釉质表面由含蛋白质的唾液薄膜覆盖,先锋菌黏附分子与薄膜中蛋白质受体键合而吸附于其上。(2)后继菌定植。通过同种间聚集和异种间共聚集组成多样化的菌群,其间有些菌株在共聚集中起着桥梁作用,如血链球菌在内氏放线菌与龋齿罗氏菌中起桥梁作用,具核梭杆菌在早期和后继菌之间起桥梁作用组成多样化的菌群。(3)各菌种属的繁殖组成群居的社会。(4)细菌从生物膜脱附着,传播或定植到其他部位。在营养物质有限的环境中,处于休眠状态的细菌群组的生活方式不是每种属细菌的单独行为而是各菌种(属)细菌功能联合起来的协同行为,这样才能降解大的复合营养分子。生物膜中细菌的营养物质来自唾液或龈沟液来源的糖蛋白,分解这些大分子的物质需要几个酶连续有序的活动,如蛋白酶、肽酶,糖酵解酶,它们来自各种不同的细菌,靠这些细菌有序的联合作用而使大分子营养物质为众多细菌共享。当环境中某些营养物质过度丰盛时,如糖,会使生物膜中产酸菌属代谢活跃并且繁殖,生物膜中的生态失衡,遂使生理性的生物膜成为病理性的生物膜,以致发生生物膜附着的牙釉质脱矿成龋。对牙菌斑中产酸、耐酸细菌如变形链球菌(S.mutans)、乳酸杆菌在龋病发生发展中的作用曾给予高度重视和研究,但从生态系统的观点探索牙菌斑内非产酸菌的作用也一直是学者们研究的课题。朱敏等分离出牙菌斑中的奈瑟菌和韦永菌,并探讨了它们与变形链球菌之间的关系,明确了奈瑟菌产酸和分解酸的双重作用及其减龋的可能潜力。国外学者对变形链球菌以外的链球菌亚种给予关注,如格登链球菌(S.gordonii)、轻链球菌、口腔链球菌,它们被称为低pH链球菌组或非变形链球菌组,对龋病发生发展的作用不能忽视。张杰等从健康人口腔中分离出一种口腔链球菌,其有黏附和耐酸能力,但产酸能力弱,凭借其乳酸氧化酶能将变形链球菌所产的酸分解为H2O2,因而命名为寡发酵链球菌(streptococcusoligofermentans),此菌多由健康牙面检出,并且与菌斑内的变形链球菌在数量上呈负相关,因而推测此菌可能具有抑制致龋菌的潜力。牙菌斑中的致龋菌既能产酸又有耐酸的特性,在致龋作用上,后者比前者更重要。探索致龋菌的耐酸相关基因,为近年龋病病因研究的热点。卫华等采用转座子TN917随机诱变变形链球菌株UA159,筛选出耐酸缺陷株,从而发现一个新的与耐酸性相关的基因。朱敏等从一株干酪乳杆菌中得到耐酸相关基因ffh的部分片段。杨德琴等对不同龋敏感人群变形链球菌产酸、耐酸毒力因子的遗传多态性进行了研究,在基因表型和mRNA表达水平上认识了变形链球菌产酸耐酸因子LDH和F-ATpase的遗传多态性特征及其与菌株毒力、龋易感性的关系。根据众多的牙菌斑与龋病、牙周病的研究资料,Marsh提出生态菌斑学说(ecologicaldentalplaquehypothesis),这个学说总括了特异菌斑学说(loesche)和非特异菌斑学说(theilade),其中心思路为口腔常见病特别是龋和牙周病的发生是因牙菌斑生态失衡而致。与龋病和牙周病有关的细菌均为口腔内的常居菌丛成员,正常情况下细菌之间、细菌与宿主之间处于动态平衡中,不发生疾病,也不存在特异的致病菌,只有在环境条件、饮食因素改变时这个动态平衡失调,遂使生理性牙菌斑成为病理性牙菌斑,如宿主摄糖频繁使菌斑内产酸菌活跃、繁殖而致龋。1.4牙菌斑生物膜中密度感应系统在多样化的细菌社会中,有许多机制调控菌属间彼此作用及它们与环境的作用。细菌在一个小环境中达到一定的数量时,就会产生调控性胞外化学信息,当这些信息分子达到一定的浓度时细菌细胞内的靶基因,就会被激活或抑制,细菌的生存基于这些调节机制。当某些细菌感觉到环境中有其他细菌大量存在时,就会减缓其代谢作用,以防止营养物质消耗和代谢废物聚集。革兰阳性与革兰阴性菌的密度感应的分子机制不同。革兰阳性菌的信息是通过一个称之为感受态刺激肽(competencestimulatingpeptide,CSP)的小肽和胞内调控系统(组氨酸激酶受体和反映调控因子)传递。当CSP达到一个阈值时,细菌的次级群体分解出DNA于环境中,这些DNA可由其他有能力的细菌摄取,摄取外界环境中的DNA并转递,对细菌基因物质交换颇为重要,是细菌无性繁殖的主要方式。通过交换DNA使细菌基因组变异,这对于细菌改革过程是必要的。研究表明,CSP能控制生物膜的生长,CSP缺陷的变形链球菌株生物膜生成减少。CSP为菌属内密度感应信号,基因Luxs是菌种属间密度感应信号。黄正蔚等采用同源重组方法,利用红霉素耐药基因emr置换变形链球菌基因组中的Luxs基因构建Luxs基因缺陷株,并研究其对生物膜早期生成的影响。革兰阴性菌的密度感应信号分子为酰化的同型丝氨酸内酯(acylatidhomoscrinelactore,AHLS),当此物质在生物膜中的浓度超过阈值时,即可启动基因表达的变化。当AHLS扩散到细胞浆,可上调特殊基因的转录,因而影响活性蛋白的产生,生物膜结构也受到影响。1.5变形球中总蛋白的表达众所周知,基因是遗传信息的携带者,而蛋白质是生命活动的执行者,在生物膜生成过程中细菌在胞内外表达的蛋白质在其中起着重要作用,Wilkins等等用热裂解法破碎变形链球菌UA159细胞壁,再用溶解蛋白质的溶液提取总蛋白,采用双向电泳分离出(188±28)个蛋白质点。有研究发现,生物膜细菌与浮游态细菌的蛋白质合成不同,浮游态细菌表达的蛋白质数量为生物膜细菌的1.5倍。这些研究均表明,研究者们已初步从整体水平分析不同条件下蛋白质表达谱的变化,从而寻找功能蛋白质,阐明疾病(龋病、牙周病)发生机制,探求药物治疗的靶标。1.6细菌耐药性增加生物膜对抗生素的耐药性为近年医学界十分关注的问题。近年资料显示,50%以上的金葡菌是甲氧苯青霉素的耐药菌株,称为methicillin-resisctent(MRSA)。细菌快速的种代延续和摄取环境中DNA的能力使得细菌特别易于变异。细菌后天性对抗生素耐药性就是细菌活性变异的类型之一。此外生物膜细菌比浮游态生存的细菌对抗生素不敏感,往往杀灭生物膜细菌的药物浓度为浮游态的千百倍,因此在临床中药物的疗效往往不如实验室中显现的效力。针对这一现象的解释:(1)生物膜中药物的穿透力减低。许多体外实验表明,生物膜年龄愈老,大分子质量葡聚糖在其中的扩散力愈弱。(2)生物膜中菌细胞在休眠状态下生存,生长缓慢。(3)抗生素某些成分在达到细菌前即与生物膜的胞外多糖键合。(4)生物膜中菌种的生理性异质化在浮游态不表达的基因,在生物膜中表达。(5)存在表型变种,如persister细菌细胞。综上所述,针对牙菌斑生物膜的研究结果,学者们提出对龋病、牙周病发病机制的研究应从对个别的菌种转向牙菌斑生物膜生态上来。2能力状态间的互动关系流行病学研究及实验室研究均已阐明,饮食中的蔗糖是最有致龋性的食物。它可由牙菌斑生物膜中细菌发酵,是生物膜中胞外多糖和胞内多糖(IPS)合成的底物。牙菌斑生物膜中的多糖可分为两类,即细胞外多糖和细胞内多糖,前者促使细菌在牙表面黏附并可影响牙菌斑生物膜的物理和生化特性;后者为内源性糖的来源,当环境中营养物质有限时能供细菌代谢产酸;这两种多糖在生物膜致龋性中起重要作用。为探索牙生物膜中致龋菌水平升高原因,Brdshaw等研究发现,在葡萄糖冲击后环境中pH值下降时,变形链球菌和乳酸杆菌的活菌计数百分比与pH7.0时相比分别增加19和180倍,当生物膜环境处于低pH值时,变形链球菌和乳酸杆菌相互竞争生存,抑制了非致龋菌种的生长和代谢。本研究提示,牙生物膜中微生物间的平衡被破坏不是由于糖的可利用性而是由于糖代谢而产生的低pH环境。近年两个原位研究发现,与葡萄糖、果糖和淀粉相比,蔗糖更促进致龋性,与等浓度的葡萄糖与果糖的混合物相比蔗糖使釉质矿物质的脱失多于前两者,当把蔗糖与淀粉联合应用时淀粉的致龋性增强,由此学者们认为蔗糖是独一无二的致龋性糖。以蔗糖为底物,细菌的GTF合成的胞外多糖,主要是不溶水葡聚糖,是牙生物膜结构的实体,可增加牙菌斑生物膜的体积和造成多孔结构,可使更多的基质扩散到牙釉质表面,以致生物膜的深层出现较低的pH值。Hata等采用在变形链球菌GTF和果糖基转移酶(FTF)编码区等位基因交换方法构建变形链球菌的突变株,计量突变株与其亲代野生株不溶水葡聚糖的产量,发现野生株的产量多于突变株,并且H+较快地扩散。也有研究报道,变形链球菌的gefB和gefC基因缺乏株,较其亲代菌株的致龋性明显减弱。Aires等研究发现,在有蔗糖环境中生成的生物膜比没有蔗糖环境中生成的生物膜胞外多糖含量多,pH下降的速度亦较快,促进牙釉质脱矿的趋势也强。近年研究发现,生物膜中无机离子如钙、磷、氟的浓度可能与胞外多糖含量相关,在蔗糖存在环境中生成的生物膜中胞外多糖含量多,而钙、磷、氟无机离子则呈低浓度,这些无机离子在龋的发生发展中具有重要价值。一般,当pH下降时这些无机离子被释出到牙菌斑生物膜与牙釉质的界面,而维持一个饱和的液相,当牙菌斑生物膜中胞外多糖浓度增多,基质中钙、磷、氟浓度减少,从而促使牙釉质脱矿。近年研究牙菌斑生物膜基质中胞外多糖含量与无机离子浓度相关的机制多从以下几个方面着手:(1)矿物储库的消耗。由于糖发酵而出现的低pH,使无机离子从牙釉质中释出,并扩散到唾液中,遂形成一个有着低无机离子浓度的生物膜。(2)牙釉质从生物膜体液中摄取无机离子。(3)释放的无机离子键合到细菌胞壁上,从而起到牙菌斑中离子储库的作用。(4)细菌的低密度。由于胞外多糖量增多在生物膜占有的体积也大,由此而来减少了细菌的数量及其键合部位。(5)钙、磷、氟同时呈现的低浓度可能与牙菌斑生物膜的蛋白成分相关。虽然从上述几个角度进行研究,但迄今尚未阐明生物膜胞外多糖增多而无机离子浓度降低的确切机制。3模型主义测定牙齿存在于唾液的环境中,唾液的流速、流量和唾液内的有机成分和无机成分均与牙齿硬组织的健康密切相关。早些研究已表明,龋易感者的唾液黏稠度、流速、流量均低于少龋或无龋者。头颈部肿瘤患者接受放射治疗后唾液腺被破坏,唾液分泌明显减少而引发猛性龋。自从Gibbon(1984)提出口腔细菌黏附的识别系统以来,学者们对附着在牙釉质表面薄膜的蛋白质受体进行了广泛研究,已经发现许多细菌的黏附素和相应的薄膜中受体,如变形链球菌表面几种蛋白质黏结素与之相结合的唾液黏蛋白、淀粉、酶、富脯蛋白,远缘链球菌的结合葡聚糖蛋白和葡聚糖受体,黏性放线菌的Ⅰ、Ⅱ型菌毛与富脯蛋白、富酪蛋白和半乳糖残基,某些革兰阴性厌氧杆菌的植物凝集素样