中国药典药品微生物检查

中国药典2021版药品微生物检查

指导原那么罗慧萍四川省食品药品检验所2021年3月1我国微生物检查开展概况抑菌剂效力检查法指导原那么药品微生物检验替代方法验证指导原那么微生物限度检查法应用指导原那么药品微生物实验室标准指导原那么2我国微生物检查开展概况3我国开展药品无菌检查和微生物限度检查已有数十年的历史。新中国第一部药典〔1953年版〕收载了无菌检查法，以后每部进行了不断的修订和完善，从样品的取样量到培养时间的变化都更加的科学，合理。我国药品微生物限度检查起步较晚，始于1972年。41972年我国开展药品微生物污染检查工作，经几年的调查研究，1978卫生、化工、商业三部联合颁发了我国第一个“药品卫生标准〞。该标准主要为中药、化学药，按丸、片、散、冲及糖浆、合剂、水剂等剂型规定了微生物限度。包括细菌总数、霉菌总数；口服药品1g或1ml不得检出大肠埃希菌、沙门菌，外用药品1g或1ml不得检出铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌；口服药品不得检出活螨。1980年版?药品卫生检验方法?中收载了破伤风梭菌检查法，并对用于深部组织、创伤、溃疡及阴道用药开始检查破伤风梭菌。至此形成了我国药品微生物限度检查法及限度标准的根本框架。

5中国药典1990年版第二增补本收栽20个化学药品种的微生物限度标准。中国药典1995年版收载了微生物限度检查法，对少数剂型收载了微生物限度。按剂型制订微生物限度标准，是根据我国国情决定的。从开展看，以品种来制定标准较为合理。由于新剂型层出不穷，按剂型制订微生物限度标准十分复杂，中国药典2005年版开始根据用药途径制订药品微生物限度标准，无论化学药或中药制剂的微生物限度，都有大的变动，同时对含药材原粉和含豆豉、神曲等发酵成分的制剂增订了检查大肠菌群及含豆豉、神曲等发酵成分的制剂还增订了细菌数、霉菌和酵母菌数。2005版药典在无菌和微生物限度检查法中首次明确了方法验证的概念。6

2021版药典起草的指导思想一、以科学开展观为统领，效劳于资源节约型社会、环境友好型社会的要求；落实科学监管理念，着力解决开展中的问题。二、与时俱进，广泛吸纳先进技术与成果；坚持自主与创新；积极推进药品标准化战略，提高我国药品标准总体水平，着力提升?中国药典?在国际社会中的地位和作用，提高综合竞争力，促进医药产业的健康开展，为构建社会主义和谐社会作出奉献。72021版药典起草的根本原那么一、坚持保障药品质量、维护人民健康的原那么二、坚持继承、开展、创新的原那么三、坚持科学、实用、标准的原那么四、坚持质量可控性原那么五、坚持标准先进性原那么六、坚持标准开展的国际化原那么82021版药典在2005版的根底上增订了白色念珠菌的检查，规定眼用制剂按无菌制剂要求，明确用于烧伤或严重创伤的外用剂型均按无菌要求。中药橡胶膏剂首次提出不得检出致病菌检查要求。新增抑菌效力检查法指导原那么、药品微生物检验替代方法验证指导原那么、微生物限度检查法应用指导原那么、药品微生物实验室标准指导原那么等，以缩小附录在微生物检查方面与国外药典的差距。2021版中国药典，我国药品无菌、微生物限度检查方法和标准在科学性、合理性以及与国际接轨方面均有了长足进展，使我国药品无菌和微生物限度检查步入了一个崭新的时期。9抑菌剂效力检查法指导原那么10如果药物本身无足够的抗菌力，在正常储存和使用过程中〔尤其是多剂量制剂〕可能发生微生物污染和大量繁殖，对患者造成感染或引起药物变质。最近我国白内障病人感染铜绿假单胞菌事件，以及目前国外尚在调查的博士伦护理液的问题，足以提醒我们此类制剂微生物污染的严重后果。在生产过程中添加适合的抑菌剂可以保证药品在正常储存和使用过程中的质量。目前欧洲、美国、英国等国药典均已在附录中收载了抑菌剂效力测定，我国2021版药典增订抑菌剂效力检查法指导原那么，目的在于缩短与欧美国家的距离，评价最终产品的抑菌效力，同时也可用于指导生产企业在研发阶段制剂中抑菌剂确实定。11所有抑菌剂都具有一定的毒性，而且在贮存过程中其有效性有可能因药物的活性成分提高或降低，为保证药品的质量和用药平安，添加抑菌剂的量应根据制剂本身是否具抗菌活性，保持最低有效量。抑菌剂效力的测定可为生产过程中添加抑菌剂提供指导，随着科学开展，新型抑菌剂大量出现，抑菌剂效力的测定更为重要；使生产者正确掌握产品中添加抑菌剂的效力，有助于选择适宜的抑菌剂，也可对抑菌剂使用的正确性给予评价。12抑菌剂效力检查法系用于测定灭菌、非灭菌制剂中抑菌剂的活性，以评价最终产品的抑菌效力，同时也可用于指导生产企业在研发阶段制剂中抑菌剂确实定。如果药物本身不具有充分的抗菌活性，那么应根据制剂特性〔如水溶液制剂〕添加适宜的抑菌剂，以防止制剂在正常贮藏和使用过程中可能发生的微生物污染和繁殖使药物发生变质而对使用者造成危害，尤其是多剂量包装的制剂。在药品生产过程中，抑菌剂不能用于替代药品生产的GMP管理，不能作为非灭菌制剂降卑微生物污染的唯一途径，也不能作为控制多剂量包装制剂灭菌前的生物负载的手段。13所有抑菌剂都具有一定的毒性，制剂中抑菌剂的量应为最低有效量。同时，为保证用药平安，最终包装容器中的抑菌剂有效浓度应低于对人体有害的浓度并在药品包装上注明添加抑菌剂的名称和数量。在制剂通那么中要求具有抗菌活性的制剂，不管是添加的抑菌剂，还是药物本身具有抗菌活性，在药物研发阶段，均应确认其抗菌效力。抑菌剂的抗菌效力在贮存过程中有可能因药物的成分或包装容器等因素影响而提高或降低，因此，应验证最终容器中的抑菌剂效力在效期内不因贮藏条件而降低。本试验方法和抑菌剂抑菌效力判断标准用于包装未启开的成品制剂。14抑菌剂效力测定实验1.培养基：胰酪胨大豆肉汤培养基；胰酪胨大豆琼脂培养基；沙氏葡萄糖液体培养基；沙氏葡萄糖琼脂培养基。用于抑菌剂效力测定的培养基必须通过适用性检查。测定细菌用胰酷胨大豆琼脂培养基，测定真菌用沙氏葡萄糖琼脂培养基。2.菌种：同培养基适用性检查，假设需要，制剂中常见的污染微生物也可作为试验菌株。制备成浓菌液〔108cfu/ml〕。

153.供试品接种：为了到达试验目的，根据供试品的给药途径和用途将供试品分为四类，以便标准的制定和执行。1类注射剂、其他非肠道制剂，包括乳剂、耳用制剂、无菌鼻用制剂及眼用制剂2类局部给药制剂、非灭菌鼻用制剂及用于黏膜的乳剂3类口服非固体制剂〔非抗酸制剂〕4类非固体抗酸制剂16抑菌剂效力可能受试验用容器特征的影响，如容器的材质、形状、体积及封口的方式等。因此，只要供试品每个包装容器的装量足够试验用，同时容器便于按无菌操作接入试验菌液、混合及取样等，一般应将试验菌直接接种于供试品原包装容器中进行贮存。每一容器接种一种试验菌，接种量按供试品类别确定。假设因供试品的性状或每个容器装量等因素需将供试品转移至无菌容器时，该容器的材质不得影响供试品的特性〔如吸附作用〕，特别应注意不得影响供试品的pH，pH对抑菌剂的活性影响很大，同时容器的口径大小应便于供试品的进出及混匀。17取包装完整的供试品至少5份，直接接种试验菌，或取适量供试品分别转移至5个适宜的无菌容器中〔假设试验菌株数超过5株，应增加相应的供试品份数〕，每一容器接种一个试验菌。1、2、3类供试品1g或1ml接种菌量为105～106cfu，4类供试品中1g或1ml接种菌量为103～104cfu，接种菌液的体积不得超过供试品体积的0．5%～1%，充分混合，使供试品中的试验菌均匀分布。184.贮存：接种的供试品在试验期间置20~25℃避光贮存，控制温度变化尽可能小，并防止被污染。5.存活菌数测定：根据产品类型及表2规定的时间，分别从上述每一容器取供试品1ml〔g〕，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释成1：10；1：100；1：1000等稀释级，按验证过的菌数测定方法〔由于供试品中含有抑菌活性，所以菌数测定方法应进行验证〕测定供试品中所含的菌数，并换算成lg值。

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6.结果判断：计数结果与初始值〔0时菌数〕的常用对数值比较，根据表2进行判断。试验结果按有效数字的修约规那么进舍，保存一位小数。结果符合表2要求可判断该产品抑菌效力符合规定。20表防腐剂抗菌效力标准1类供试品细菌7天菌数下降不少于1.0lg，14天菌数下降不少于3.0lg，第14天到28天菌数不增加。真菌与初始值比，到7、14、28天菌数均不增加。2类供试品细菌14天菌数下降不少于2.0lg，14天到28天菌数不增加。真菌与初始值比，到14、28天菌数均不增加。3类供试品细菌14天菌数下降不少于1.0lg，14天到28天菌数均不增加。真菌与初始值比，14、28天菌数均不增加。4类供试品细菌，真菌与初始值比，14、28天菌数均不增长。注：1、表中“不增加〞是指对前一个测定时间，试验菌增加的数量不超过0.5lg。2、0时菌数供试品参加试验菌，摇匀，立即取样检查，培养，计数，为0时，即初始值。21实例1、氯化钠注射液、碳酸氢钠注射液不含抑菌剂参加菌从初始到6h就开始无限增加，不具抑菌力，抗病毒口服液从初始到24h对数值无变化，72h后明显降低，具一定的抑菌力。2、呋麻滴鼻液、硫糖铝混悬液、阿昔洛韦滴眼液、鲸脂滴耳液、洁尔阴洗液从初始值到7天后计算值大于1.0lg降低值，从初始值到14天后计算值大于3.0lg,具较强的抑菌效力。3、波斯特是特效抑菌剂具极强的抑菌效力，72h抑菌效力达100%。采用对数值计算简便、结果准确、易于判断。22药品微生物检验替代方法验证指导原那么23本指导原那么是为所采用的试验方法能否替代药典规定方法用于药品微生物的检验提供指导。三类微生物检验的新技术〔1〕基于微生物生长信息的检验技术，如生物发光技术、电化学技术、比浊法等；〔2〕直接测定被测介质中活微生物的检验技术，如固相细胞计数法、流式细胞计数法等；〔3〕基于微生物细胞所含有特定组成成分的分析技术，如脂肪酸测定技术、核酸扩增技术、基因指纹分析技术等。24微生物检验的新技术与传统的检验方法比较，具有检验简便，速度快的特点，有实时或近实时监控的潜力，能够对生产过程的关键工艺环节作出及时的微生物质量评价，使生产早期采取纠正措施及监控和指导优良生产成为可能，同时，新技术的使用也促进了生产本钱降低及检验水平的提高，因此在医药行业完全有必要也有可能使用微生物检验的替代方法。采用非药典规定的替代方法进行微生物检验时，应进行替代方法的验证，确认其应用效果优于或等同于药典的方法。假设替代方法只是针对药典方法的某一环节进行技术修改，那么验证仅针对该替代技术而非整个检验方法。25

药品微生物检验方法分为定性试验和定量试验。定性试验是测定样品中是否存在活的微生物；定量试验是测定样品中存在的微生物数量。替代方法的验证也分为定性和定量两类，不同类型需要验证的参数不同，验证参数的设定借鉴了美国和欧洲药典的规定，但又结合了我国国情。具体参数的设定见下表。26参数定性检验定量检验准确度－＋精密度－＋专属性＋＋检测限＋－定量限－＋线性－＋范围－＋重现性＋＋耐用性＋＋注：＋表示需要验证－表示不需要验证27替代方法的一般要求在以替代方法对样品检验的适用性进行验证前，必须证明所选用的替代方法具有方法适用性，即说明在不含样品的情况下，替代方法的专属性、精密度、检测限等参数。确认方法的适用性后，用样品按上表规定的参数进行验证。验证至少用2个批号的样品，每批样品每个菌应至少平行进行三次独立实验。参数验证的菌种应包括培养基适用性检查规定的菌种，必要时，还应根据替代方法及样品的特性增加相应的菌种。28定性检验的方法验证291、专属性：是指检测样品中可能存在的特定微生物种类的能力。强调应关注样品存在对检验结果的影响在使用依赖培养技术〔以微生物生长作为判断〕的替代方法时，样品的存在会导致检验出现假阴性，应特别确认培养基的促生长试验及样品的存在对检验结果的影响。对于不依赖培养技术的替代方法，样品的存在还可能导致检验出现假阳性，应特别确认检测系统中的外来成分不得干扰试验，确认样品的存在不会对检验结果造成影响。采用替代方法进行控制菌的检验，还应选择与控制菌具有类似特性的菌株作为验证对象。302、检测限：是指在替代方法设定的检验条件下，样品中能被检出的微生物的最低数量，该数量是指在稀释或培养之前初始样品所含有的微生物数量，而不是指检验过程中某一环节的供试液中所含有的微生物数量。验证的关键是确定接种菌的最低数量〔每单位不超过5cfu〕，分别用药典方法和替代方法对该菌进行检验，比较两种方法的差异。与国外药典规定相同，要求试验菌的接种量应能够在采用药典方法检验时，有50％的检出率。检测限验证至少应重复进行5次。313、重现性：是指相同的样品在正常的实验条件〔如实验场所、实验人员、仪器、试剂的批次等〕发生变化时，所得检验结果的精密度。反映了微生物检验方法在检验结果上抵抗操作和环境变化的能力。验证的关键是使接种菌的量在检测限以上，评价验证结果时，应排除样品均一性的影响4、耐用性：是指当方法参数有小的刻意变化时，检验结果不受影响的能力，为方法正常使用时的可靠性提供依据。对替代方法进行耐用性评价，确定方法操作的关键注意点。在开展了上述评价后，可以不必比较替代方法的耐用性与药典方法的差异。32定量检验的方法验证331、准确度：是指替代方法的检验结果与药典方法检验结果的一致程度。准确度确实认应在检验的范围内。通常用微生物的回收率〔％〕来表示准确度。验证的菌浓度应该在检测范围内，一般应选择能够准确计数的最高浓度，系列稀释至较低浓度，并且至少应该有5种浓度，每种浓度重复检验5次。替代方法的回收率应该到达70％以上。当替代方法并不依赖微生物生长出菌落或出现混浊来进行定量时，可能出现回收率高于药典方法的情况，此时应结合专属性的内容对准确性进行评价。342、精密度：是指在检验范围内，对同一个均匀的样品屡次重复取样测定，其检验结果的一致程度。通常采用标准偏差或相对标准偏差〔变异系数〕来表示。验证的菌浓度同准确度，每种浓度重复检验10次。可以接受的相对标准偏差〔RSD〕应不大于35％。一般来说，替代方法的相对标准偏差〔RSD〕应不大于药典方法。在该工程上，USP的规定是15％～35％，研究说明，当含菌浓度在30～300cfu/ml时，计数结果的RSD完全可能在15％以内，因此，指导原那么中对该指标作了修改。

353、专属性：是指通过检测适宜的试验菌，以证明检验方法与其设定目的相适应的能力。例如，菌落计数平皿法其设定目的在于检出一定数量的微生物，那么其专属性验证应证明当样品中存在一定数量的试验菌时，通过平皿法检验，能够检出试验菌，而样品的存在不会对结果造成影响。验证的关键是合理评价样品的存在对检验结果的影响，当替代方法不依赖微生物生长出菌落或出现混浊就可以定量时，这种评价显得尤为必要。4、定量限：是指样品中能被准确检验的微生物最低数量。验证的关键是在检验范围的低限，选择尽可能低的5种菌浓度，每种浓度重复测定5次，替代方法的定量限不得大于药典方法。365、线性：是指在检验范围内，检验结果与样品中微生物数量成比例关系的程度。线性验证时必须覆盖能够准确检测的所有浓度范围。每株菌至少应该有5种浓度，每种浓度至少测定5次。在对验证数据进行处理时，应以样本中预期的菌浓度为自变量，以不同方法的计数结果为因变量，进行线性回归分析，计算相关系数，替代方法的相关系数不得低于0.95。6、范围：是指能够到达一定的准确度、精密度和线性，检验方法适用的上下限浓度或数量的区间。377、重现性：是指相同的样品在正常的实验条件〔如实验场所、实验人员、仪器、试剂的批次等〕发生变化时，所得检验结果的精密度。反映了微生物检验方法在检验结果上抵抗操作和环境变化的能力。验证的关键是使接种菌的量在检测限以上，评价验证结果时应制备均一的实验样本8、耐用性：是指当方法参数有小的刻意变化时，检验结果不受影响的能力，为方法正常使用时的可靠性提供依据。当检验方法采用基于培养的技术时，一般的参数变化是指对培养温度和时间进行调整，上述调整对检验结果的影响并不显著。38微生物限度检查法应用指导原那么39此原那么的制定是为了更好应用微生物限度检查法，对标准和方法中的特定内容及标准的应用做进一步说明。应用此原那么应结合2021年版?中国药典?微生物限度检查法详细解读。主要对以下各条作了明确。40对所用试剂的要求：有效性和无毒性。检验方法的选择：尽量选择操作简便，快速及防止损伤供试品中污染的微生物的方法。对离心沉淀法的重新认识：尽量防止采用该方法，更不宜采用高速离心沉淀集菌。对照培养基的说明：由中检所研制及分发。无法消除供试品的抑菌作用时，可根据供试品应符合的微生物限度标准和菌数报告规那么选择更高稀释级试验。416.控制菌的进一步确认应选择已被认可的菌种鉴定方法。7.药品的生产、贮存、销售及新药标准制定、进口药品标准复核、考察药品质量、仲裁中，除品种或制剂通那么项下另有规定外，其微生物限度均以药典的“药品微生物限度标准〞为依据。428.2021年版二部化学药制剂通那么项下⑴有微生物限度要求的制剂，微生物限度为必检工程；⑵对于只有原那么性要求的制剂〔如：丸剂、口服片剂、胶囊剂、颗粒剂〕，应对其被微生物污染的风险进行评估。在保证产品对患者平安的前提下，通过回忆性验证或在线验证积累的微生物污染数据说明每批均符合微生物限度标准的要求，那么可不进行批批检验，但必须保证每批最终产品均符合微生物限度规定。43⑶上述固体制剂假设因制剂本身及工艺的原因导致产品易受微生物污染，应在品种项以下出微生物限度检查项及微生物限度标准，如生化类制剂。9.对局部给药制剂控制更严格。用于手术、烧伤及严重创伤的局部给药制剂应符合无菌检查法要求。对于创伤程度无法判断的局部给药制剂，假设没有证据证明药品不存在平安性风险那么应符合无菌检查法要求。

4410.制定药品的微生物限度标准时，除了依据“药品微生物限度标准〞外，还应综合考虑原料来源、性质、生产工艺条件、给药途径及微生物污染对患者的潜在危险等因素，提出合理平安的微生物限度标准，因此，必要时，特殊品种为保证其疗效、稳定性及防止对使用者的潜在危害性，应制定更严格的微生物限度标准，并在品种项下规定，如眼用液体制剂，目前其生产工艺及生产条件尚难到达无菌产品的要求，但从使用者的平安性考虑，建议按无菌产品的要求进行控制。制定辅料、化学原料药、中药提取物的微生物限度标准时，除参照相应制剂的微生物限度标准外，还应综合考虑相应制剂及其生产工艺的特性。4511.2021年版一部对动物类原药材粉作了明确规定，利于标准的正确理解和执行。具体规定如下：含动物类原药材粉的口服中药制剂要求不得检出沙门菌。其中的动物类原药材粉是指除蜂蜜、王浆、动物角、阿胶外的所有动物类原药材粉，如牡蛎、珍珠等贝类，海蜇、等水产品，冬虫夏草、人工牛黄等。46药品微生物实验室标准指导原那么47药品微生物实验室标准指导原那么用于指导药品微生物检验实验室的质量控制。药品微生物的检验结果受到很多因素的影响，如实验人员在取样或试验过程中可能引入了污染微生物；微生物学分析方法本身的误差较大；样品中或环境中微生物可能分布不均匀等因素均影响药品微生物实验结果。因此，在药品检验中，为保证微生物试验数据的可靠性和重现性，药品微生物实验室必须使用经验证的检测方法并按良好的实验室标准指导试验。48药品微生物实验室标准包括以下几个方面：人员、培养基、菌种、实验室的布局和运行、设备、文件、实验记录、结果的判断等。49一、人员从事药品微生物试验工作的人员均要受到教育、培训及具备相关工作的经验。

微生物实验人员应具备微生物学或相近专业知识的教育背景。

实验室应依据实验人员的岗位及职责对其进行相应的培训，在确认他们可以承担某一试验前，他们不能独立从事该项微生物试验。应保证所有人员在上岗前接受胜任工作所必需的设备操作、微生物检验技术和实验室生物平安等方面的培训，经考核合格前方可上岗，同时，实验室应制定所有级别实验人员的继续教育方案。50微生物实验室管理人员包括工作人员和监督人员，其专业技能和经验水平应与他们的职责范围相符。管理人员也应接受系统的教育和微生物实验室的培训如：管理技能、实验室平安、试验按排、预算、实验室研究、实验结果评估和数据偏差的调查及技术报告书写等。应熟练的应用SOP有关内容到管理工作中；如制定不同工作岗位实验人员的培训课程和继续教育方案，随时掌握和了解试验人员的水平，根据每个人的技术水平分配适宜的工作岗位。对所有人员的培训、考核内容和结果均应记录。51二、培养基培养基是绝大多数微生物试验的根底。因此，培养基的质量是微生物试验成功与否的关键因素。适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质量控制试验是提供优质培养基的保证。52

⑴培养基的制备：可按处方制备也可使用按处方生产的符合规定的商品化成品培养基，脱水培养基除附有处方和使用说明外还应注明有效期、贮存条件、适用性试验的质控菌株和用途。配制时应按使用说明上的要求操作，受潮结块不能使用，以确保培养基的质量符合要求。53配制培养基使用的容器应是玻璃器皿或搪瓷器皿如搪瓷筒、量筒、漏斗、三角烧瓶、刻度吸管、试管、培养皿等。使用的器皿应洗净，用蒸馏水冲净，烘干前方可使用。禁用金属容器如铁、铜、铝容器，防止金属离子与培养基成分结合，生成有害物质，影响细菌生长。配制培养基最常用的溶剂是纯化水，特殊情况下需要用去离子水和蒸馏水，对热敏感的培养基应用灭菌水和无菌容器配制与分装，配制时假设需加热助溶应注意温度不要过高。54配制培养基必须矫正pH，枯燥培养基也必须对pH进行验证，高压灭菌前的pH应比最终pH高0.2左右。配制好的培养基应按照生产商提供或使用者验证的参数进行灭菌。商品化的成品培养基必须附有所用灭菌方法的资料，培养基灭菌一般采用湿热灭菌技术,特殊培养基可采用薄膜过滤除菌。对配制培养基的过程作详细的记录，记录内容包括：配制日期、培养基名称、成分、配制数量、灭菌条件、质量监控结果等进行全面详细记录。55〔2〕培养基的贮藏商品化培养基应根据使用说明书上的要求进行储存。培养基标签上应标有批号，生产日期、有效期及培养基的有关特性。所采用的保藏和运输条件应使培养基最低限度失去水分并提供机械保护。配制好的培养基应保存在避光的环境。假设保存于非密闭容器中，一般在三周内使用；假设保存于密闭容器中，一般在一年内使用，琼脂培养基不得在0℃或0℃以下存放，防止冷冻破坏凝胶特性。假设培养基要长期保存，琼脂平板应密闭包装或置于密闭容器中以防止水分流失。56

培养基灭菌后应立即取出，不得储藏在高压灭菌器中，防止影响培养基的质量。固体培养基灭菌后的再融化应在加热的水浴中或采用流通蒸汽进行，只允许一次，融化的培养基应放在45～50℃的水浴中，不得超过8小时。57

〔3〕培养基的质量控制所有配制好的培养基均应进行验证，验证方法参照?中国药典2021年版?附录无菌检查或微生物限度检查项下有关规定进行。实验室配制的培养基的常规监控工程是外观、性状、pH、促生长试验、定期的稳定性检查以及培养基有效期确实定。在实验室中，由同一批脱水培养基配制培养基时，假设采用已验证的配制和灭菌程序，那么可不进行批批促生长试验。如果培养基制备的方法未经验证，那么，配制的每一批培养基必须进行促生长试验。

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用于环境监控的培养基应特别小心防护。尤其是用于关键区域监控的培养基最好要双层包装和终端灭菌，如果不能采用终端灭菌的培养基，那么在使用前应进行100%的预培养。这样是为了防止将外来的污染带到环境中及防止出现假阳性结果。

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无菌检查用培养基使用前应进行适用性试验，适用性试验包括无菌性检查和灵敏度检查，无菌性试验是检查培养基灭菌是否完全，灵敏度检查是确定培养基的质量好坏、稳定与否，这对检验结果有极为重要的影响。微生物限度检查培养基

使用前应进行适用性试验，适用性试验包括促生长、抑制及指示能力检查。60三、菌种微生物实验过程中，实验菌株可能是最敏感的，因为它们的生物活性和特性依赖于适宜的试验操作和贮藏条件。实验室菌种的处理和保藏的程序应标准化，使尽可能减少菌种污染和生长特性的改变。按统一操作程序制备菌株是微生物试验结果一致性的重要保证。试验菌种应是从国家菌种中心获得的标准菌种，经过实验室复活并在适宜的培养基中生长后保存.61菌种保藏机构中国菌种保藏管理委员会〔CCCCM〕成立于1979年。下设7个菌种保藏管理中心及有关专业实验室，共12个单位实行统一领导，按专业分工管理。普通微生物菌种保藏管理中心〔CCGMC〕中国科学院微生物研究所中国科学院武汉病毒研究所农业微生物菌种保藏管理中心〔ACCC〕中国农业科学院土壤肥料研究所医学微生物菌种保藏管理中心〔CMCC〕中国医学科学院皮肤病研究所中国药品生物制品检定所中国预防医学科学院病毒研究所62工业微生物菌种保藏管理中心〔CICC〕中国食品发酵工业科学研究所抗生素菌种保藏管理中心〔CACC〕中国医学科学院医用生物技术研究所四川抗生素研究所华北制药厂抗生素研究所兽医微生物菌种保藏管理中心〔CVCC〕农业部兽医药品监察所林业微生物菌种保藏管理中心〔CFCC〕中国林业科学院专利微生物菌种保藏管理中心〔ACCC〕武汉大学63国外的菌种保藏机构世界菌种保藏联合会〔WFCC〕美国标准菌种收藏所〔ATCC〕美国农业部北部地区研究实验室〔NRRL〕英国国立标准菌种收藏所〔NCTC〕英国国际真菌研究所〔CMI〕荷兰真菌中心保藏所〔CBS〕日本微生物菌种保藏联合会〔JFCC〕64标准菌株的复活或培养物的制备应按供给商提供的说明或按验证的方法进行。标准储藏菌株—从国内、外菌种收藏机构获得的标准菌株经复活并在适宜的培养基中生长后,既为标准储藏菌株。

65菌种的保存低温、枯燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都可以抑制微生物的代谢和生长繁殖，因此低温、枯燥和真空是菌种保藏的重要手段。不同的微生物，应根据其生物特征来选择最适宜的保藏方法。66菌种培养基保存温度传接时间细菌一般为营养琼脂斜面培养基，或根据菌种规定选用培养基4～6℃芽孢菌3～6个月，其他细菌1个月酵母菌霉菌琼脂或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂斜面培养基4～6℃一般3～6个月真菌PDA琼脂或改良马丁琼脂斜面培养基4～6℃一般3～6个月琼脂斜面低温保藏法67菌种保存液（2mL）保存温度保存时间金黄色葡萄球菌营养肉汤1%蛋白胨甘油水

10%～40%甘油-30～-80℃

半年以上

枯草芽孢杆菌大肠埃希菌胆盐乳糖增菌液乙型副伤寒沙门菌铜绿假单孢杆菌生孢梭菌疱肉培养基白色念珠菌

改良马丁培养基黑曲霉液体冷冻保藏法68菌种的传代和使用

工作菌种的传代次数应严格控制，不得超过5代，〔从菌种保藏中心获得的标准菌株为第0代〕防止过度的传代造成菌种变异。1代是指将活的培养物接种到新鲜培养基中，任何亚培养的形式均被认为是转种或传代一次。必要时，实验室应对工作菌株的特性和纯度进行确认。69冻干菌种〔0代〕↓适宜的增菌液约5mL溶解苏醒〔1代〕↓增菌液培养复壮〔2代〕↓增菌液培养→→分装冷冻保存适宜的斜面培养基→使用划线传代〔3代〕↓适宜的斜面培养基划线传代〔4代〕→使用→分装冷冻保存↓适宜的斜面培养基划线传代〔5代〕→使用→分装冷冻保存70经过长期保藏和传代的菌种，由于种种原因发生衰退、变异和死亡。因此菌种在保藏期间必须定期检查，发现变异或衰退，应及时给予恢复。每隔一定时间间隔需对菌种重新复活、别离、纯化、检查鉴定和再保藏。主要检查菌落形态、革兰染色、显微镜下菌体形态、生化特性及血清学检查。71菌种的管理1、使用菌种的单位，应具备从事微生物工作的条件和设备。菌种应由专人负责管理，管理人员应具有微生物专业知识和技术水平，并应具有较强的责任心。2、实验室必须建立菌种保存和使用文件化的程序管理制度；包括：每支菌种标注名称、标准号、接种日期、传代次数、进出、收集、贮藏、保存、确认试验以及销毁的记录、标准菌种的申购记录、从标准菌株到工作菌株操作记录，如菌种定期转种传代，鉴定〔纯度、特性〕、培养基和培养条件、菌种保存的位置和条件及其它需要的程序。723、菌种应冷藏或冷冻保存，保存菌种的冰箱不得放置食品和易挥发性药品，放置菌种应有专用的冰箱，应上锁管理。4、由专人按操作规程和有关要求定期进行传代，并定期对保存的菌种进行检查，一般每年1～2次，〔或定期更换冻干菌种〕。发现菌种的异常情况应及时检查。一旦发现菌种污染和变异现象，应立即报告、研究处理。尤其长期保存时。73745、菌种的来源、接收、传代、别离、复壮、使用和鉴定等均应做好详细记录。6、菌种不得随意带出实验室，外单位索取、购置应有证明和登记登记，并包装严密。菌种处理应严格按操作规程进行，灭菌处理应有详细记录。75四、实验室的布局和运行

微生物实验室的规划和设计应充分考虑到微生物操作标准和实验室平安操作的要求，应具有进行微生物检测所需的适宜环境和设施，其中最重要的是尽最大可能防止微生物对环境、人员、样本造成污染和危害。合理的规划及活动区域的划分将提高微生物实验室操作的可靠性。无菌室应远离交通干道、厕所及污染区，应选上、下水道及其他安装适宜的位置。无菌室的配套设施包括洗刷、培养基配制、消毒灭菌、灭菌物品存放和传输、培养间、结果观察、试验菌实验和办公室等，要集中，减少污染，便于管理和使用。76通常，实验室应划分成洁净区、无菌区和培养区等，无菌区域应与培养区完全分开。否那么应采用其它屏障和无菌技术来减少偶然污染的可能性。这些屏障包括防护服、卫生处理和消毒措施及采用隔离器技术生物平安柜。微生物检验的实验室应符合?中国药典?无菌检查、微生物限度检查试验环境的要求，无菌检查、微生物限度检查、无菌采样等应有独立设置的洁净室〔区〕或隔离系统，并配备相应的细菌〔真菌〕实验室、培养室、培养基及实验用具准备〔包括灭菌〕区、样品接收和储藏区、标准菌株储藏区、污染物处理区和文档处理区等辅助区域，同时，应对上述区域明确标识。77实验室对所用的消毒剂应定期更换，使用的消毒剂应无菌。污染微生物的样品，需进一步分析鉴定，均应在阳性菌实验室进行。被检样品应有传递、储存、处置和识别管理程序。待验样品应在适宜的条件下储存并能够，应明确规定和记录储存条件。实验室应有妥善处理废弃样品和有害废弃物的设施和制度，对疑似于带菌培养物溢出的意外事件应制定处理规程。78五、设备实验室应配备与检验能力和工作量相适应的仪器设备，其种类和型号、测量范围和准确度等应满足检验的要求，设备的安装和布局应便于操作，易于维护、清洁和校准。实验室应建立完整的仪器设备管理制度,包括新进仪器设备的验收；如仪器设备的检定、校准、验证、确认其性能，并形成相应的操作、维护和保养的标准操作规程前方可正式使用。为保证设备处于良好工作状态，应定期维护和期间核查，并保存相关记录。79重要的仪器设备，应由专人负责，保证其运行状态正常和受控，同时应有相应的备用设备以保证试验菌株和微生物培养的连续性；对于培养箱、冰箱、高压灭菌锅等影响实验准确性的关键设备应在其运行过程中对关键参数〔如温度、压力〕进行连续观测和记录〔有条件的情况下尽量使用自动记录装置〕，如果发生偏差，应评估对以前的检测结果造成的影响并采取必要的纠正措施。对于一些容易污染微生物的仪器设备如水浴锅、培养箱、冰箱和生物平安柜等应定期进行清洁和消毒。对试验需用的无菌器具应有明确标识，实施正确的清洗、灭菌措施，并形成相应的标准操作规程80六、文件保证检测质量是任何实验室管理中的核心。每一个进行检验的实验室必须建立并遵守质量保证〔QA〕的政策和程序，用所建立的QA政策和程序来监测和评价整个检验过程。所有QA活动都必须文件化。81七、记录正确的试验研究和实验记录是微生物试验成功的关键。要使实验结果可信最根本的原那么是试验应按SOP规定的内容进行操作；如正确的试验操作、完整的实验记录，以便确认数据的完整性。实验记录至少应包括以下内容：编号、实验日期、实验材料、操作程序、实验结果、误差、文件参数〔使用的设备、菌种、培养基〕，每一个关键的实验设备的校准过程及设备维护均需记录，如设备温度〔水浴，培养箱，灭菌器〕、检验依据、实验人员签名、复核人签名、管理人员签名。必须记录和监测。82为保证实验记录的真实性，实验记录应是原始记录，用签字笔或蓝黑墨水记录，当记录出现错误时，不得抹去或被覆盖，应用单线划线并签字。所有的实验数据都要登记、存档。83八、结果的判断一、影响试验结果的因素药品微生物检验较为特殊，因是活微生物，受到外界影响因素较，因此检验结果分析比较困难，其影响因素有以下几方面：

1、微生物在自然界中普遍存在。2、实验人员在样品处理过程或其它操作步骤可能受微生物污染。3、微生物在样品或环境中分布不均匀等。

84以上原因造成试验结果的误差大和重现性差，因此，在试验时应尽最大程度的防止外来的污染。应对实验结果进行全面分析，如果实验结果不符合标准规定，应立即通知实验室管理人员，组织进行原因调查分析。分析内容包括：⑴实验室环境⑵抽样区的防护条件⑶样品本身是否具有影响微生物存活或繁殖的成分和作用⑷实验操作是否标准以上都是评价实验结果真实性的重要依据。85

如果依据分析调查结果发现，试验全过程中任何一个环节有错误，可判实验结果无效，那么应重新制定实验方案，按照正确的方案进行实验，在这种情况下，应特别认真对试验过程及正确的试验操作进行监控，实验室必须认可复试程序，如果需要，重新抽样，但抽样方法不能影响不符合规定结果的分析调查，这种情况必须详细记录。86

谢谢！872pL-kH%gCZbyU6tP2oL)kG%fCYbxU6sP1oK)jG$fBYaxT6sO1nK(jF$eBXawT5sO1nJ(iF!eAX9wS5rO0nJ*iE!dAW9vS4rN0mJ*hE#dzW8vR4qN+mI*hE#czV8uR3qM+lI&hD#cyV7uQ3pM-lH&gDZcyU7tQ2pL-kH%gCZbyU7tP2oL)kG%fCYbxU6tP1oK)jG$fBYaxT6sP1oK(jF$eBXawT5sO1nK(iF!eAX9wS5rO0nJ(iE!dAW9vS4rN0mJ*iE!dzW8vR4qN+mI*hE#dzV8uR3qM+lI&hD#czV7uQ3pM-lH&gDZcyV7uQ2pL-kH%gCZbyU7tQ2oL)kG%fCYbxU6tP2oK)jG$fBYaxT6sP1oK)jF$eBXawT5sO1nK(jF!eAX9wS5rO0nJ(iF!dAW9vS4rN0mJ*iE!dAW8vR4qN+mI*hE#dzW8uR3qM+lI&hD#czV8uQ3pM-lH&gDZcyV7uQ3pL-kH%gCZbyU7tQ2pL)kG%fCYbxU6tP2oL)kG$fBYaxT6sP1oK)jG$eBXawT5sO1nK(jF$eAX9wS5rO0nJ(iF!eAX9vS4rN0mJ*iE!dAW9vR4qN+mI*hE#dzW8vR3qM+lI&hD#czV8uR3qM-lH&gDZcyV7uQ3pM-kH%gCZbyU7tQ2pL-kG%fCYbxU6tP2oL)kG%fBYaxT6sP1oK)jG$fBXawT5sO1nK(jF$eBX9wS5rO0nJ(iF!eAX9wS4rN0mJ*iE!dAW9vS4qN+mI*hE#dzW8vR4qM+vR4qN+mI&hD#czV8uR3qM+lI&gDZcyV7uQ3pM-lH&gDZbyU7tQ2pL-kH%gCZbxU6tP2oL)kG%fCYbxT6sP1oK)jG$fBYaxT6sO1nK(jF$eBXawT5sO0nJ(iF!eAX9wS5rO0mJ*iE!dAW9vS4rN0mJ*hE#dzW8vR4qN+mI*hD#czV8uR3qM+lI&hDZcyV7uQ3pM-lH&gDZcyU7tQ2pL-kH%gCZbyU6tP2oL)kG%fCYbxU6tP1oK)jG$fBYaxT6sP1nK(jF$eBXawT5sO1nJ(iF!eAX9wS5rO0nJ(iE!dAW9vS4rN0mJ*iE#dzW8vR4qN+mI*hE#czV8uR3qM+lI&hD#czV7uQ3pM-lH&gDZcyV7tQ2pL-kH%gCZbyU7tP2oL)kG%fCYbxU6tP2oK)jG$fBYaxT6sP1oK(jF$eBXawT5sO1nK(iF!eAX9wS5rO0nJ(iF!dAW9vS4rN0mJ*iE!dzW8vR4qN+mI*hE#dzV8uR3qM+lI&hD#czV8uQ3pM-lH&gDZcyV7uQ2pL-kH%gCZbyU7tQ2oL)kG%fCYbxU6tP2oL)jG$fBYaxT6sP1oK)jF$eBXawT5sO1nK(jF$eAX9wS5rO0nJ(iF!eAW9vS4rN0mJ*iE!dAW8vR4qN+mI*hE#dzW8vR3qM+lI&hD#czV8uR3pM-lH&gDZcyV7uQ3pL-kH%gCZbyU7tQ2pL-kG%fCYbxU6tP2oL)kG$fBYaxT6sP1oK)jG$eBXawT5sO1nK(jF$eBX9wS5rO0nJ(iF!eAX9vS4rN0mJ*iE!dAW9vR4qN+mI*hE#dzW8vR4qM+lI&hD#czV8uR3qM-lH&gDZcyV7uQ3pM-kH%gCZbyU7tQ2pL-kH%fCYbxU6tP2oL)kG%fBYaxT6sP1oK)jG$fBYawT5sO1nK(jF$eBXawS5rO0nJ(iF!eAX9wS4rN0mJ*iE!dAW9vS4rN+mI*hE#dzW8vR4qN+lI&hD#czV8uR3qM+lH&gDZcyV7uQ3pM-lH&gCZbyU7tQ2pL-kH%gCYbxU6tP2oL)kG%fCYaxT6sP1oK)jG$fBYaxT5sO1nK(jF$eBXawT5rO0nJ(iF!eAX9wS5rN0mJ*iE!dAW9vS4rN0mI*hE#dzW8vR4qN+mI&hD#czV8uR3qM+lI&gDZcyV7uQ3pM-lH&gDZbyU7tQ2pL-kH%gCZbxU6tP2oL)kG%fCYbxT6sP1oK)jG$fBYaxT6sO1nK(jF$eBXawT5sO0nJ(iF!eAX9wS5rO0nJ*iE!dAW9vS4rN0mJ*hE#dzW8vR4qN+mI*hD#czV8uR3qM+lI&hD#cyV7uQ3pM-lH&gDZcyU7tQ2pL-kH%gCZbyU6tP2oL)kG%fCYbxU6tP1oK)jG$fBYaxT6sP1nK(jF$eBXawT5sO1nJ(iF!eAX9wS5rO0nJ(iE!dAW9vS4rN0mJ*iE#dzW8vR4qN+mI*hE#czV8uR3qM+lI&hD#czV7uQ3pM-lH&gDZcyV7tQ2pL-kH%gCZbyU7tP2oL)kG%fCYbxU6tP2oK)jG$fBYaxT6sP1oK(jF$eBXawT5sO1nK(jF!eAX9wS5rO0nJ(iF!dAW9vS4rN0mJ*iE!dzW8vR4qN+mI*hE#dzW8uR3qM+lI&hD#czV8uQ3pM-lH&gDZcyV7uQ2pL-kH%gCZbyU7tQ2pL)kG%fCYbxU6tP2oL)jG$fBYaxT6sP1oK)&gDZcyV7uQ3pM-kH%gCZbyU7tQ2pL-kH%fCYbxU6tP2oL)kG%fBYaxT6sP1oK)jG$fBXawT5sO1nK(jF$eBXawS5rO0nJ(iF!eAX9wS4rN0mJ*iE!dAW9vS4qN+mI*hE#dzW8vR4qN+lI&hD#czV8uR3qM+lH&gDZcyV7uQ3pM-lH&gCZbyU7tQ2pL-kH%gCYbxU6tP2oL)kG%fCYaxT6sP1oK)jG$fBYaxT5sO1nK(jF$eBXawT5rO0nJ(iF!eAX9wS5rN0mJ*iE!dAW9vS4rN0mI*hE#dzW8vR4qN+mI&hD#czV8uR3qM+lI&gDZcyV7uQ3pM-lH&gDZbyU7tQ2pL-kH%gCZbxU6tP2oL)kG%fCYbxT6sP1oK)jG$fBYaxT6sO1nK(jF$eBXawT5sO0