杨梅果实提取物抑菌活性的研究

杨梅果实提取物抑菌活性的研究

梅西属植物科，为杨梅科多年生多年生小树。杨梅是原产中国的亚热带果树之一,喜温暖湿润气候,耐阴,不耐强烈日照。中国是杨梅种的原产地,也是主产区,大致分布在北纬18~33°之间,东起台湾东岸,西至云南瑞丽,北至陕西汉中,南至海南三亚,地跨北、中热带和北、中、南亚热带。经济栽培主要集中在东南沿海的浙江、江苏等地。作为我国的传统特产水果,杨梅味甘酸而性温,有生津止渴、和胃消食、益肾利尿及消暑诸功能。明代医学家李时珍所著的《本草纲目》中记载:“杨梅味酸甜,性温、无毒。能止渴、和五脏、涤肠胃,除烦溃恶气。”《开宝本草》中记载:杨梅“主去痰、止呕、断下痢,清食解酒”。杨梅果实中含葡萄糖和果糖、维生素﹑柠檬酸、氨基酸、多种维生素、蛋白质、脂肪、苷类等,SugaA从杨梅果实和种子中分离出2个新三萜、1个新甾体、1个新木脂素以及35个已知化合物。ZhongxiangFang等从杨梅果实中分离出了三种酚类物质(没食子酸、儿茶酸和栎精三苷)和多种杨梅黄酮糖苷以及杨梅黄酮脱氧糖苷派生物。杨梅的药用价值极高,其果实、仁、叶、皮均可入药。我国民间历来用酒制杨梅来止腹痛、腹泻,确有立竿见影之功效。目前国内外对杨梅的研究,大部分集中在杨梅的保鲜、杨梅中花色苷以及杨梅树叶、树皮等的研究。杨梅果实的研究仅限于成分分析、保鲜、产品的开发方面,对杨梅果实提取物抑菌作用的研究尚未见报道。本文详细报道了杨梅乙醇提取物对几种常见菌株的抑制作用,以及有关理化因素对其抗菌活性的影响,阐明了其抗菌特性,旨在能开发出一种天然的食物防腐剂,同时也为杨梅的深度利用开辟一条新途径。1材料和方法1.1菌株与培养基新鲜的大浮杨梅:无锡马山。大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)、溶血性链球菌(Streptococcushaemolyc)、志贺氏痢疾杆菌(Shigelladysenteriae)、黑曲霉(Aniger)均由无锡市疾病预防与控制中心提供。细菌以营养琼脂培养基进行斜面活化,霉菌以马铃薯培养基进行斜面活化。PYX-DHS-40-50-BS隔水式恒温培养箱,R-501旋转蒸发器,HYG-II回转式恒温调速摇瓶柜,LS-B50型立式圆形压力蒸气灭菌器,DELTA-320pH计,W-501升降恒温水浴锅。1.2杨树莓原汁的制备将购买的新鲜杨梅洗净、沥干,称量相同质量(300g/份)的杨梅分装,分别加入相同体积(1L)的95%的乙醇溶液浸泡6个月以上,浸提液经过抽滤,旋转蒸发(55℃,80r/min),将得到的浓缩液定容至1g/mL,置于冰箱中保存,作为待测液,即杨梅粗提物浓度为1g/mL,即每毫升提取物中含有原料杨梅1g。本文中涉及的杨梅果实乙醇提取物的浓度均按此定义。1.3菌种细菌从斜面挑取菌株,细菌经37℃/24h,霉菌经28℃/24h恒温摇瓶培养(180r/min),然后菌液用无菌生理盐水稀释成10-1、10-2、10-3等不同浓度梯度的菌液,各吸取1mL分别加入已灭菌冷却的平面培养基中涂布均匀后培养(细菌:37℃/24h;霉菌:28℃/24h),根据观察结果选取适宜的菌液浓度。1.4抗菌特性的测定1.4.1养基、培养基的制备用管碟法。取无菌培养皿(直径90mm、高18mm,大小一致,皿底平坦)20套,每皿加入融化的20mL牛肉膏蛋白胨培养基作为底层,凝固。用灭菌的微量移液枪移取0.1mL菌液(菌液浓度1×106~6×106cfu/mL)加入上述已倒好平皿的培养基中,涂布均匀,待凝固后每平板等距离放置3个灭菌牛津杯(内径6mm,外径8mm,高10mm),将上述提取液200μL加入牛津杯,每个菌种做5组平行,以无菌生理盐水为对照。按1.3所述条件培养,量取抑菌圈直径,记录结果。1.4.2菌悬液的制备用试管连续二倍稀释法:将10支灭菌试管排成一列、编号,各加入灭菌普通肉汤1mL,在第1管内加入1g/mL的提取物1mL,混匀后吸取1mL到第2管,混匀再取1mL到第3管,依次类推到第9管,弃去1mL,第10管不加提取物,然后每管加入菌液0.1mL(菌悬液106cfu/mL),混匀,置37℃恒温培养24h。结果判定:肉汤清亮透明表示无细菌生长(-),肉汤浑浊表示有细菌生长(+),以能抑制细菌生长的杨梅提取物最高稀释度作为其最低抑菌浓度(MIC)。以生理盐水作对照。1.4.3微生物培养平板将1.2所述提取物分装在5个无菌三角瓶中,经70℃/30min、80℃/20min、90℃/10min、100℃/5min处理,冷却后待用。采用平板菌落计数法,制成含杨梅提取物的微生物培养平板(提取物与培养基体积比为1∶10,菌液浓度103~104cfu/mL),以无菌生理盐水做对照实验。37℃下恒温培养24h后,观察平板中菌落的生长情况并计数,分别测定抑菌率:1.4.4不同ph值对实验动物的微生物培养平板调节培养基的pH值,制成pH值分别为5、6、7、8的营养琼脂培养基。用平板菌落计数的方法,制成含杨梅提取物的不同pH值环境的微生物培养平板(同1.4.3),凝固后置于恒温箱中培养(37℃,24h)。以无菌生理盐水为实验对照。37℃下恒温培养24h后,观察平板中菌落的生长情况并记数,分别测定抑菌率(同1.4.3)。1.4.5成糖液和成液平板的制作选取志贺氏痢疾杆菌为供试菌株,分别向培养基中添加0、10%、20%、50%的蔗糖,制成含不同糖浓度、含有提取物的微生物培养平板(同1.4.3),同时以无菌生理盐水做对照。37℃下恒温培养24h后,观察平板中菌落的生长情况并计数,分别测定抑菌率(同1.4.3)。1.4.6与盐的结合可以预防和污染选取志贺氏痢疾杆菌为供试菌株,分别向培养基中添加0、3%、5%、10%的NaCl,其余同1.4.5。2结果与分析2.1抑菌圈和抑菌圈从表1可看出,杨梅果实提取物对金黄色葡萄球菌、志贺氏痢疾杆菌、溶血性链球菌和伤寒沙门氏菌具有良好的抑菌作用,抑菌圈大小:溶血性链球菌>金黄色葡萄球菌>志贺氏痢疾杆菌>伤寒沙门氏菌,而对大肠杆菌和黑曲霉几乎没有抑菌作用。2.2总体抑菌能力各样品试管与对照试管相比较,可以明显看出试管内肉汤培养基的浑浊度,试验结果(表2)表明,随着杨梅提取物浓度的增加,抑菌能力也增加,杨梅粗提物对各菌株的最低抑菌浓度分别为:金黄色葡萄球菌0.031g/mL,志贺氏菌和沙门氏菌为0.125g/mL,链球菌为0.062g/mL。2.3加热预处理对抗菌效果的影响从图1可看出,杨梅提取物对预处理温度以及时间的长短不敏感,基本没有大的影响,说明提取物对热具有良好的稳定性。2.4ph值对抑菌效果的影响结果显示(图2),pH值对杨梅果实提取物的抑菌能力具有较大的影响,随着pH值的降低,抑菌效果显著增强,在pH5时,几乎对每种供试菌的抑制率都达到了95%以上,特别对金黄色葡萄球菌的抑制作用。2.5盐、糖的添加量在含盐、糖的溶液里,杨梅果实提取物的抑菌作用明显加强(图3、图4),添加的盐、糖的浓度越大,抑菌率也随之增大,这表明杨梅果实提取液与盐、糖有较强的协同作用,其作用机理应该与盐、糖本身也是食品防腐剂有关。3总体抑菌活性实验证明,杨梅果实粗提物对常见致病菌金黄色葡萄球菌、志贺氏痢疾杆菌、溶血性链球菌和伤寒沙门氏菌具有良好的抑菌作用,最低抑菌浓度(MIC)分别为0.031g/mL(金黄色葡萄球菌)、0.125g/mL(志贺氏菌)、0.125g/mL(沙门氏菌)、0.062g/mL(链球菌);杨梅乙醇提取物对热具有良好的稳定性,与盐、糖具有良好的协同抑菌作用,另外提取物的抑菌活性受pH的影响较大,其抑菌活性随着pH值的降低而提高。植物是生物活性化合物的天然