gh基因多态性的pcr-sscp检测与分析

gh基因多态性的pcr-sscp检测与分析

采用聚合酶链反应反应单链结构多态性分析（pcr-scp）方法，研究了牧场红足基因（gh）遗传多态性。为确定可用于标记的分子标记，并为中国优质特色牛提供理论基础。1材料和方法1.1pcr扩增剂草原红牛68头,来自吉林省农业科学院,利用颈静脉采血,ACD抗凝,-20℃保存,备用。TaqDNA聚合酶、dNTPs、蛋白酶K等试剂,购自北京鼎国生物技术有限责任公司;pMD-18载体试剂盒、PCR产物回收试剂盒和质粒提取试剂盒,购自宝生物工程(大连)有限公司。1.2方法1.2.1na样品溶液利用常规的苯酚/氯仿抽提方法提取基因组DNA,用TE溶液将DNA样品稀释,-20℃保存,备用。用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法双重检测DNA的纯度和浓度,然后稀释成30ng/μL,备用。1.2.2基因序列和引物试验所用GH引物是参照参考文献,并根据已发表的牛GH基因(accessionnumberM57764)的碱基序列设计的,6对引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列、PCR产物大小、位置见表1。1.2.3rtaq聚合酶活性反应物体系共25.0μL,其中包括灭菌去离子水18.6μL,30.0ng/μL的DNA模板1.0μL,10×Buffer2.5μL,2.5mmol/L的dNTP1.0μL,10pmol/L的上下游引物各0.7μL,3U/μLrTaq聚合酶0.5μL。PCR反应循环参数:94℃预变性5min;94℃变性30s,55～65℃复性40s,72℃延伸30～40s,35个循环;最后72℃延伸10min。1.2.4聚丙烯酰胺凝胶的tbe电泳2μLPCR产物加10μL变性上样缓冲液,98℃变性10min后,立即冰浴10min,然后上样置于预冷的聚丙烯酰胺凝胶上。试验根据扩增片段的大小,将30%的聚丙烯酰胺凝胶(29∶1)配成8%～12%的聚丙烯酰胺凝胶,以160V电压于1×TBE电泳14～18h。电泳结束以后,首先在70%乙醇中固定10～15min,用去离子水洗2次,每次2～3min;银染30min(100mL染色液中含NH3·H2O1mL,0.36%NaOH21mL,20%AgNO31.8mL),再用去离子水洗3～4次,每次2～3min,加入显色液(200mL显色液中含1%柠檬酸钠1mL,甲醛100μL),待电泳条带清晰后换上去离子水停显。1.2.5质粒提取和测序进行PCR-SSCP分析后,将不同纯合子基因型个体的PCR扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳分离、纯化回收,回收后的DNA与pMD-18载体连接,并转化到大肠杆菌DH5α菌株中,蓝白斑筛选后经PCR扩增鉴定阳性克隆,提取质粒DNA进行序列测定。2结果与分析2.1sscp分析对GH基因的内含子3进行扩增,产物经2%的琼脂糖凝胶检测,获得了与目的片段大小一致的产物(345bp),带型清晰且无杂带,稳定性和特异性好(见图1),可进行SSCP分析。PCR产物经SSCP分析结果表现出3种基因型(见图2)。对P1RF的两种纯合基因型AA、BB克隆测序,并用DNASTAR比对分析,结果见图3。结果表明,在1435bp处有一个T→C的突变(与GenBankaccessionM57764相比而得),导致等位基因A变为等位基因B;在1692处有C→T的突变(与YaoJ等1996年的研究结果相同),但并未导致新的等位基因出现。2.2基因型的检测由图4可见,在8%的聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳条件下对PCR产物进行PCR-SSCP分析,在不同个体中检测到了3种基因型(CC、CD、DD)。对P2RF的两种纯合基因型CC、DD克隆测序,发现该位点在1918处有C→A的突变(与GenBankaccessionM57764相比而得),导致等位基因C变为等位基因D,序列比拼结果见图5。2.3和2对等位基因控制利用30%的聚丙烯酰胺配制成浓度为12%凝胶,160V电压电泳18h,结果表明,该位点由1对等位基因控制(E、F)。对PCR产物中的纯合子基因型克隆测序,由序列比较结果(见图7)可以看出:于GH基因外显子5的2291bp处发生了1处碱基A→C突变。2.4gh和3gh基因基因型的分析在8%的聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)、160V电泳扩增结果见图9条件下进行PCR-SSCP分析,结果表明,在不同个体中检测到了3种基因型,见图10。根据PCR-SSCP结果,将GG和HH两种纯合基因型进行克隆测序,DNASTAR比对分析,发现在GH基因3′UTR位点2639处有C→G突变,导致等位基因由G变为H,导致HaeⅢ增加一个酶切位点;在2735bp处有T→C(与GenBankaccessionM57764相比而得)突变,但是并未导致新的等位基因出现。结果见图11。2.5sscp分析对GH基因的5′UTR片段进行PCR扩增(结果见图12),经2%的琼脂糖凝胶检测,获得与目的片段大小一致的464bpPCR产物,带型清晰且无杂带。PCR产物经SSCP分析结果表现出3种基因型(见图13)。将P5RF位点的纯合基因型II、JJ个体的PCR产物进行克隆测序,与DNASTAR比对,结果见图14。由结果分析可见,该片段在431处有一个A到G的突变,导致等位基因由I变为J。2.6gh基因5utrpcr-scp分析结果利用P6RF引物对5′UTRPCR扩增(结果见图15)后,其产物进行PCR-SSCP电泳分析,结果如图16所示。3gh基因多态性生长激素是调节动物生长发育和三大物质代谢过程的一个重要内分泌因子。bGH基因定位于19号染色体上,由5个外显子和4个内含子组成,长约2856bp。国内外研究报道证实,GH基因遗传多态性与牛的生长发育、屠宰和胴体性状、泌乳和肉质性状有不同程度的相关性。试验以PCR-SSCP的方法,首次研究了基因全长在草原红牛群体中的的遗传多态性,结果发现在GH基因的第3内含子、第4内含子、第5外显子的3′端和5′端存在丰富的等位基因突变。这与YaoJ等1996年的研究结果相同,但在草原红牛群体中,并未导致新的等位基因出现。第4内含子在1918bp处有C→A的突变,而YaoJ等的报道则是在2017bp处碱基T→C突变,高雪等报道,在1947bp处有T→G突变,该位点的突变需要进一步探讨。本试验中GH基因外显子52291bp处有A→C突变,与YaoJ等报道的一致。研究对草原红牛GH基因的全基因组序列进行了多态性分析,发现了大量的突变位点,