绿豆提取物抑菌活性的研究

绿豆提取物抑菌活性的研究

美竹，又名青豆，是指同一年生草本植物的种子。绿色植物中含有许多生物活性物质，如硫酸酶、香豆素、碱、植物酒精、糊精素和黄酮，具有清热解毒的功效。根据开宝草本植物的记录，“绿色植物，甘、寒、毒。进入心脏和胃经，主要是防风、感冒、热汗、奔腾海豚、生研、绞蛋、煮熟、消肿、益气、压热、解毒”。正如《预虫篇》所说，“治疗肿胀和皮疹的能力与红豆相同，但它能促进热量和解毒。它不仅具有益气、厚胃、通经络、久服枯人的禁忌，而且对伤口的治疗也有非常有效的内科医生。具有内科医生和内科医生的作用。据研究，清热解毒的毒性包括外源性毒和内源性毒。外源性毒是指细菌、内毒素和病毒。抗菌抗菌可以作为清热解毒的重要属性。因此，对绿茶提取物进行了抗菌作用研究，选择了抗菌的有效成分，为绿茶排毒作用研究提供了理论依据。1实验设备和材料1.1hzq-fps研究绿豆市售;无水乙醇、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇等均为国产分析纯;山梨酸钾广州市益均明化工有限公司;青霉(penicillium)、根霉(rhizopus)、曲霉、枯草芽孢杆菌(Bacillussabtilis)、白色葡萄球菌(staphylococcusalbus)、大肠杆菌(escherichiacoli)、黏红酵母(Phodotorulaglutinis)哈尔滨商业大学生物工程实验室提供;HZQ-F160振荡培养箱哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;超净工作台哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;HZQ-D恒温振动器哈尔滨市东联电子技术开发有限公司.1.2提取物的制备取绿豆磨粉,70%的乙醇50℃水浴回流提取3次,时间分别为2、1.5、1h,合并3次提取液,用3层纱布过滤后4800r/min离心,取上清液旋转蒸发得到浸膏,用蒸馏水溶解浸膏得到悬液,然后用石油醚除去脂类和色素后再依次用氯仿、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取,所得萃取液分别减压浓缩,真空干燥得到提取物.1.3u3000含菌量的测定在超净工作台上进行无菌操作.增菌培养后,用生理盐水将菌悬液稀释成含菌量(集落形成单位,cfu):细菌为1.0×108,霉菌为1.0×106.1.4滤纸法测定抗菌效果1.4.1抑菌圈直径测定取直径为6mm的圆形滤纸片于121℃下湿热灭菌备用.然后将滤纸片分别放入质量浓度为10mg/mL的绿豆乙醇提取物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物溶液中浸泡30min.在超净工作台上,将试验菌株均匀涂抹于培养基平板表面,用镊子将滤纸片放入平板上,每个平板放3个重复样,包好放入培养箱中培养,培养好后用游标卡尺测量其抑菌圈直径(mm).1.4.2抑菌圈直径测定根据1.4.1中筛选出抑菌效果好的萃取物,然后将滤纸片分别放入此萃取物质量浓度为10、1、0.1、0.01、0.001mg/mL的溶液中浸泡30min.在超净工作台上,将试验菌株均匀涂抹于培养基平板表面,用镊子将滤纸片放入平板上,每个平板放3个重复样,包好放入培养箱中培养,培养好后用游标卡尺测量其抑菌圈直径(mm).1.5绿色提取物对抗菌活性的稳定研究1.5.1抑菌活性测定将绿豆提取物用无菌水稀释成质量浓度为10mg/mL的溶液,作为原液.取部分原液分别置于30、40、50、60、70℃水浴条件下各处理30min,用抑菌圈直径法测定处理前后样品的抑菌效力.实验重复3次.1.5.2紫外灯照射对抑菌活性的影响将绿豆提取物用无菌水稀释成质量浓度为10mg/mL的溶液,作为原液.取部分原液分别置于紫外灯下照射10、30、50、70、90min,用抑菌圈直径法测定处理前后样品的抑菌效力.实验重复3次.1.5.3抑菌活性的测定将绿豆提取物用无菌水稀释成质量浓度为10mg/mL的溶液,作为原液.取部分原液pH值用缓冲溶液调为6.0、7.0,、8.0、9.0、10,并用缓冲溶液pH值为6.0、7.0、8.0、9.0、10做对照.用抑菌圈直径法测定处理前后样品的抑菌效力.实验重复3次.1.6关于抗菌有效结论的初步研究1.6.1压缩剂的抑菌活性测定研究发现绿豆含有多种生物活性物质,如鞣类、香豆素、生物碱、植物甾醇、皂苷和黄酮等化合物.为了更好的研究绿豆中抑菌有效成分,对绿豆提取物的成分进行粗测.1.6.2薄检绿豆提取物用合适的展开剂进行展开,对斑点染色,根据颜色变化判断提取物的成分.2结果与讨论2.1萃取物的抗菌效果2.1.1正丁醇萃取物的抑菌效果由表1可以看出,绿豆乙醇提取物对细菌有良好的抑菌效果,对霉菌几乎无抑菌效果.通过两相萃取到的萃取物,其中正丁醇萃取物的抑菌效果均强于氯仿和乙酸乙酯萃取物,其抑菌圈直径比乙醇提取物大.说明正丁醇萃取物抑菌有效成分含量较多,相对抑菌质量浓度较大.2.1.2正丁醇提取物低质量对青霉的影响从表2可以看出,正丁醇提取物对枯草芽孢杆菌、白色葡萄球菌、大肠杆菌、青霉都有不同的抑制作用,但对根霉和曲霉几乎没有抑制作用,说明正丁醇提取物并非对所有病源菌的生长都有抑制作用,而是具有选择性的.正丁醇提取物低质量浓度下对根霉没有抑制作用,只有当绿豆提取物溶液质量浓度达到10mg/mL时,才对青霉有抑制作用;白色葡萄球菌、大肠杆菌在较低质量浓度时绿豆提取物溶液仍表现出一定的抑制作用;而枯草芽孢杆菌对绿豆提取物溶液质量浓度比较敏感,在0.001mg/mL时对其没有抑制作用,大于0.001mg/mL时抑菌圈随着质量浓度的增加明显变大,因此选用枯草芽孢杆菌为正丁醇提取物抑菌活性稳定性试验的指示菌株.2.3乙醇提取物的稳定性试验2.3.1抑菌活性的稳定性从图1可以看出,正丁醇提取物在30~70℃范围内抑菌圈变化在8~9mm之间,抑菌效果差别不大,基本保持原有的抑菌效力.结果表明,绿豆提取物抑菌活性在30~70℃范围内具有良好的热稳定性.说明正丁醇提取物中抑菌有效成分在80℃后遭到破坏.2.3.2u3000抑菌效果从图2可以看出,随着紫外线照射时间的增加,抑菌圈直径变化在6~8mm之间,抑菌效果差别不大,基本保持原有的抑菌效力.结果表明,绿豆提取物抑菌活性对紫外线具有较高的稳定性.2.3.3正丁醇提取物溶液ph值对抑菌活性的影响从图3可以看出,pH值为6.0、7.0、8.0、9.0、10的缓冲溶液对枯草芽孢杆菌有一定的抑菌作用.从图4可以看出,当正丁醇提取物溶液pH值为6.0、9.0、10时,较原液抑菌圈直径有明显的降低,抑菌效力有所下降.只有当pH值为7.0~8.0时,抑菌效力与原液差异不大.结果表明,pH值为7.0~8.0时绿豆提取物溶液抑菌活性较稳定.2.4固定醇组分的测定结果通过样品成分的定性测定结果,可知正丁醇提取物中含有一定量的黄酮类、酚类、有机酸及皂苷类等成分,而不含有蒽醌及其苷类、生物碱.2.5fpse的检测正丁醇萃取物用甲醇溶解,点样2μL,利用薄层层色谱进行分离.筛选出展开剂为乙酸乙酯∶正丁醇∶醋酸∶水=4∶1∶1∶1,展开5点,从下到上(见图5)编号为F1、F2、F3、F4和F5,Rf值依次为0.23、0.36、0.54、0.70、0.80.用10%的三氯化铝乙醇溶液染色,F4点在紫外灯下观察,黄色加深有黄绿色荧光,用氢氧化钾染色,在紫外灯下观察显示黄绿色荧光,结合表3中的现象,判断此成分为黄酮;用10%硫酸乙醇溶液溶液染色,在110℃干燥箱下观察,F1、F2、F3显示紫色,结合表3中的现象,判断是皂苷.F5点在薄层下显示绿色,由于石油醚未除去,可能是水溶性色素类成分.这5种成分的具体结构还需进一步研究.3不同菌种的抑制作用绿豆提取物具有广泛的抑菌活性,其