souiq-5诱导鼻咽癌细胞自噬

souiq-5诱导鼻咽癌细胞自噬

端粒是真核细胞染色体的自然末端。它在预防染色末期的分解和融合、维护染色体稳定性以及抵制染色末端的复制方面发挥着重要作用。人端粒DNA由5′-(TTAGGG)-3′重复序列和一个3′悬突端(overhang)组成,富含鸟嘌呤重复序列的DNA链能够形成G-四链体。SYUIQ-5是具有吲哚和喹啉结构的白叶藤碱衍生物,我们曾报道它能稳定和诱导G-四链体,并能抑制c-myc启动子和端粒酶活性。自噬是一种进化过程高度保守的细胞行为,是细胞在能量缺乏、代谢等压力下的自我降解过程。自噬不仅具有维持细胞自我稳态、促进细胞生存的作用,过度上调的自噬作用也可以引起细胞死亡,即“自噬性细胞死亡”,也称为Ⅱ型程序性细胞死亡。很多研究表明自噬在细胞的生长、发育和疾病发生中起着重要的作用。我们的前期研究发现Atg5敲除能抑制SYUIQ-5介导的自噬和细胞死亡,说明SYUIQ-5通过诱导自噬促进肿瘤细胞死亡。本实验进一步研究SYUIQ-5诱导肿瘤细胞自噬及其分子机制。1材料和方法1.1血清因子及谷氨酰胺的制备人鼻咽癌细胞株CNE2、CNE1、HONE1由中山大学肿瘤防治中心保存,用含有10%的胎牛血清、100μg/mL青霉素和100μg/mL链霉素、2mmol/L谷氨酰胺的RPMI-1640培养液培养。细胞在37℃和5%CO2实验条件下培养。所有实验均在细胞处于对数生长期时进行。1.2菌株和试剂胎牛血清购自Gibco公司;化学发光剂(ECL)及Beclin1、FOXO3a抗体购自CellSignal公司;Akt、p-Akt、BNIP3、GAPDH以及HRP标记的二抗均为SantaCruz公司产品;LC3抗体购于Novus生物公司,细胞裂解液来自Upstate生物技术公司;BCA蛋白定量试剂盒购自Pierce公司;M-MLV来自Promega公司;逆转录聚合酶链反应(reversetranscriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR)反应试剂、Taq酶均购自上海申能博采公司;siRNA由上海吉玛公司合成;引物由上海英骏生物技术有限公司合成;白叶藤碱类似物SYUIQ-5由中山大学药学院合成,用100%DMSO溶解,浓度为50μg/mL,-20℃储存备用。1.3逆转录pcr收集经处理的细胞,PBS洗涤2次,加入细胞裂解液100μL,12000r/min离心15min,定量蛋白,取20μg蛋白,加入上样缓冲液,95℃下变性10min。10%~15%的聚丙烯酰胺SDS凝胶电泳后,电转移至硝酸纤维膜上,5%脱脂牛奶封闭后依次加入一抗、二抗,在室温下孵育2h,TBST缓冲液(10mmol/LTris-HCl,pH7.4,150mmol/LNaCl,0.1%Tween20)洗涤3次,每次10min,暗室ECL显色。收集经药物处理的细胞,PBS洗涤2次,加入1mL的Trizol(Invitrogen),按照说明书提示的步骤抽提出RNA。在逆转录过程中,先将2μgRNA与0.5μgOlig(dT)混合,加DEPC水定量至15μL,70℃孵育5min后置于冰上;再加5μL5×M-MLV反应缓冲液,1.25μL4×dNTP(10mmol/L),1μLM-MLV(Promega,200U/μL),0.625μLRNaseOUTTM(40U/μL),并加DEPC水总反应体系调量至25μL,42℃孵育60min,然后在75℃孵育10min中止反应。PCR反应过程中,在冰上依次加入反应体系:10×PCR缓冲液(内含有MgCl2)2.5μL,4×dNTP(10mmol/L)0.5μL,cDNA1μL,P10.5μL,P20.5μL,Taq酶0.25μL,ddH2O19.75μL。按下列反应条件反应:变性94℃30s(第一个循环5min),退火55~68℃40s,延伸72℃60s(最后一次循环为10min),扩增30~35个循环。取10μL扩增产物上样到1.2%琼脂糖凝胶电泳,紫外光下观察摄影。LC3引物序列:上游引物5′-GTTGCTGACTGACCCTCCA-3′;下游引物5′-CGTCTTTCTCCTGCTCGTAG-3′。BNIP3引物序列:上游引物5′-GAAACAGATACCCATAGCA-3′;下游引物5′-GAACGCAGCATTTACAGA-3′。GAPDH引物序列:上游引物5′-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3′;下游引物5′-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCAGGTCCACC-3′。1.5免疫组化处理取处于对数生长期的细胞,稀释成3×105个/mL,接种于24孔板(孔板上铺有NUNC玻片)。24h后见细胞基本贴壁,加入药物作用一定时间后,取出玻片,PBS洗2次,用4%多聚甲醛固定细胞20min,并加入0.1%TritonX-10010min,PBS洗3次。在常温下用封闭液封闭1h后加入一抗FOXO3a,在室温下孵育2h,PBS洗3次。然后在避光下加入标记罗丹红的兔二抗,室温下孵育1h。PBS洗3次。再用DAPI染核,90%的甘油封片。最后在共聚焦显微镜下观察。1.6转染、实验和培养取处于对数生长期的CNE2细胞,用10%RPMI-1640培养液(不含血清)稀释成5×105个/mL,接种于6孔板。24h后见细胞基本贴壁,细胞密度为50%~70%,将原培养液吸出,加入转染试剂,转染终浓度为100nmol/L,培养6~8h后将转染液吸出,再加入10%RPMI-1640培养液(不含血清),并加入药物,培养一定时间后收细胞并进行相关实验。siBNIP3:正义链5′-GCUACUCUCAGCAUGAGAAtt-3′,反义链5′-UUCUCAUGCUGAGAGUAGCtg-3′。2结果2.1dmso检测用0.25~2.0μg/mL的SYUIQ-5分别处理CNE2、CNE1和HONE1细胞48h,0.1%的DMSO为对照,Westernblot检测可见LC3(LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ)表达增强,LC3-Ⅱ较LC3-Ⅰ增强更明显。BNIP3蛋白表达也随SYUIQ-5浓度的增加而增强,而CNE2细胞中Beclin1表达无明显改变(图1)。2.2sq-5处理用不同浓度SYUIQ-5(0.25~2.0μg/mL)处理CNE224h或48h,不同浓度SYUIQ-5处理CNE1或HONE148h,0.1%DMSO作为对照。PCR检测LC3和BNIP3的表达。结果可见,SYUIQ-5处理后,LC3在mRNA水平出现上调,而BNIP3mRNA无明显变化(图2)。2.3pakt蛋白表达水平测定用不同浓度的SYUIQ-5(0.25~2.0μg/mL)处理CNE2细胞48h后,Westernblot检测发现pAkt蛋白表达水平明显下降,并呈剂量依赖性(图3);而总的Akt在这一过程中无明显变化。2.4细胞定位观察用0.1%DMSO和3.0μg/mL的SYUIQ-5分别作用CNE2细胞24h后,在共聚焦显微镜下观察用药前后FOXO3a在细胞中的定位。结果表明,对照组FOXO3a主要在胞浆中分布,SYUIQ-5处理组则显示FOXO3a集中分布在胞核中(图4)。2.5westernbnip3表达用siRNA干扰BNIP3,阴性对照为一无意义的RNA片段。24h后再分别用0.1%DMSO或SYUIQ-5(0.25~2.0μg/mL)处理CNE2细胞24h,Westernblot结果如图5所示。siBNIP3组BNIP3表达显著下调,说明干扰有效;LC3表达相对NC组也明显减弱,说明BNIP3在SYUIQ-5诱导的细胞自噬中起着重要作用。3syiq-5对cne2细胞自噬和bnip3表达的影响SYUIQ-5是具有吲哚和喹啉结构的白叶藤碱衍生物,我们曾报道它能稳定G-四链体结构,抑制肿瘤细胞端粒酶活性以及诱导细胞发生迟发型凋亡。在本实验中我们发现SYUIQ-5能诱导肿瘤细胞发生自噬,抑制Akt的激活,诱导FOXO3a移位到胞核,并能上调自噬相关基因BNIP3的表达。本文主要探讨SYUIQ-5诱导细胞自噬的分子机制。自噬现象是一种高度保守的细胞行为,是细胞内物质代谢的重要途径。相对于主要降解短半衰期蛋白质的泛素—蛋白酶体系统,细胞的自噬被认为参与绝大多数长半衰期蛋白质的降解,表现为细胞浆中出现大量包裹着细胞浆和细胞器的空泡结构和溶酶体对空泡内成分的降解。自噬与细胞的生长、增殖以及肿瘤的发生密切相关。LC3是哺乳动物细胞中酵母ATG8(Aut7/Apg8)基因的同源物,定位于前自噬泡和自噬泡膜表面,是细胞自噬泡膜的通用标记物。细胞中新合成的LC3经过加工,成为胞浆可溶性LC3-Ⅰ,后者经泛素样加工修饰过程,与自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)结合,称为LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ含量的多少与自噬泡数量的多少成正比,因此LC3-Ⅱ含量的变化在某种程度上反映了细胞的自噬活性。当用SYUQ-5处理CNE2、CNE1和HONE1细胞后,LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白表达均有增加,LC3-Ⅱ较LC3-Ⅰ表达更强,增加更明显。RT-PCR显示LC3在mRNA水平也有所增强,说明SYUIQ-5处理后能在转录水平增强LC3的表达,表明SYUIQ-5能诱导肿瘤细胞发生自噬,且上调LC3的表达。作为Forkhead转录因子家族的一员,FOXO3a在骨骼肌细胞中能促进自噬相关基因LC3的转录。Forkhead转录因子家族成员是PI3K/AKTPKB信号转导途径下游重要的靶基因。AKT作为蛋白激酶,对细胞的生存和抗凋亡的调控是通过对一系列底物的磷酸化而实现的。当Akt没有被激活时,Forkhead蛋白通常位于细胞核内,促进凋亡基因的转录。当不同的生长因子刺激细胞并激活Akt后,Akt从细胞膜转移到细胞核并磷酸化FOXO3a。磷酸化的FOXO3a被转运出细胞核后与胞质蛋白14-3-3鳌合在一起而失去了对靶基因的转录功能,从而不能促进凋亡基因的转录,导致细胞增殖。因此,当细胞处于增殖状态时,FOXO3a主要分布在胞浆中。当细胞发生凋亡时,FOXO3a则主要分布在胞核中。为探讨SYUIQ-5对CNE2细胞Akt-FOXO3a途径的影响,我们用SYUIQ-5处理CNE2细胞后,发现p-AKT水平下调,而总的AKT表达不受影响。共聚焦显微镜下观察到对照组(0.1%DMSO)的FOXO3a主要分布在胞浆,而SYUIQ-5处理组则集中分布在胞核中。这说明SYUIQ-5可能通过抑制CNE2细胞中Akt的激活使FOXO3a定位于胞核,从而促进LC3的转录,增加LC3的表达,诱导肿瘤细胞发生自噬。Beclin1和BNIP3都是自噬过程中重要的调节因子。哺乳动物Beclin1是酵母Apg6/Vps30基因的同源物。有研究表明,Beclin1是Autophagy重要的正调节因子。BNIP3是bcl-2家族中BH3-only亚家族的成员,具有BH3结构域和跨膜区,属于促凋亡蛋白。BNIP3可以通过促进线粒体通透性转运孔开放和线粒体损伤而诱导凋亡,其表达受缺氧和其他因素的影响。VandeVelde等首次报道了BNIP3诱导的细胞死亡与自噬现象的发生有关。BNIP3的高表达能导致神经胶质瘤细胞发生自噬。尽管有一些实验能证明BNIP3诱导的细胞死亡与自噬有关,但其具体机制仍不太清楚。用SYUIQ-5处理后,CNE2、CNE1和HONE1的BNIP3在蛋白水平表达增强,而mRNA没有明显改变,说明SYUIQ-5引起的BNIP3高表达发生在转录后环节。用siRNA干扰CNE2细胞中BNIP3的表达后,LC3也随之减弱,说明在SYUIQ-5诱导的自噬过程中BNIP3起重要作用。目前,对于自噬究竟是阻碍肿瘤发生的屏障还是肿瘤的自我保护应答仍存在争议。在本研究中我们发现,靶向G-四链体的小分子化合物SYUIQ-5可能通过抑