益肾调周法对卵巢早衰模型大鼠外周血及下丘脑-内啡肽水平的影响

益肾调周法对卵巢早衰模型大鼠外周血及下丘脑-内啡肽水平的影响

由于卵巢功能的重要性，（iu）是妇科最常见的疾病之一。一般来说，发病率为1%3%。40岁之前的发病率为1.10，30岁之前的发病率为1.1000。发病率逐年升高。POF不仅可直接导致患者不孕、月经稀发、最终闭经,并且病程中常常伴随着烦躁、抑郁、甚至敌对等情绪改变,引起全身内分泌、免疫及代谢紊乱,严重影响患者的身心健康。因此,POF的防治是当今生殖医学研究的重点及难点。β-内啡肽(β-endorphin,β-EP)作为一种内源性的阿片肽,在女性的性腺轴的调节中起着重要的神经调节作用,本研究以付霞霏、何援利(2008年)发表的《化疗所致卵巢早衰动物模型的建立》为基础,旨在观察β-EP的变化与POF的关系及益肾调周法对下丘脑和外周血中β-EP水平的影响,探讨其作用机理,为中医药防治POF提供科学有效的思路和方法。1材料和方法1.1动物和小组1.1.1动物合格号SPF级健康雌性8周龄SD大鼠150只,质量(180±20)g,由河南省动物实验中心提供。动物合格证号:SCKx-(豫)2010-003。饲养室温控制在20～25℃,光照12h,采用分笼架式喂养方式,标准饲料,饮水为自来水。1.1.2各组常规饲养将150只大鼠按质量分层随机(随机数字表法)分组,随机分为10组,即空白对照组(A)、模型对照组(B)、克龄蒙组(C)、滋肾填精汤高剂量组(D1)、滋肾填精汤低剂量组(D2)、温肾填精汤高剂量组(E1)、温肾填精汤低剂量组(E2)、益肾调周法高剂量组(F1)、益肾调周法低剂量组(F2)、针刺治疗组(G),每组15只,分笼常规喂养。1.2主要试验材料和试剂1.2.1elisa试验剂环磷酰胺(Cyclophosphamid,CTX):山西普德药业有限公司,粉剂,200mg/支;大鼠β-内啡肽(β-EP)ELISA试剂盒:上海劲马生物科技有限公司,规格:96T,品牌:美国R&D;华佗牌30号1寸针灸针。1.2.2中药提取法滋肾填精汤(熟地,黄精,女贞子,白芍,当归,淮山药,山茱萸,川芎,合欢皮,炙甘草),由河南中医学院药理实验室制备,采用乙醇回流提取法,调整至含生药2g/ml。温肾填精汤(菟丝子,仙灵脾,仙茅,桑寄生,川断,巴戟天,何首乌,黄精,合欢皮,杜仲,木香,炙甘草),由河南中医学院药理实验室制备,采用乙醇回流提取法,调整至含生药2g/ml。克龄蒙(Climen):拜耳医药保健有限公司,片剂,21片/盒。1.3造模、注射和模型建立将分组动物连续阴道脱落细胞涂片两个周期,有动情周期的大鼠纳入组内,其余排除,并绘制组内每只大鼠的详细动情周期表。模型复制依据文献《化疗所致卵巢早衰动物模型的建立》(作者付霞霏、何援利,2008年)记载:除空白对照组外,其余9组均使用环磷酰胺给予首次负荷剂量50mg/kg后,以8mg/(kg·d)的剂量连续腹腔注射14天。空白对照组每天注射同容积生理盐水,共15天。造模完成后称质量,并连续阴道脱落细胞涂片两个性周期。阴道角化细胞持续出现7～8天(75%),无规律的动情周期变化,提示卵巢早衰大鼠模型制作成功。造模成功者,纳入组内继续实验,其余排除。1.4借贷补泻和滋肾填精汤低剂量组大鼠联合5.2.2参照《动物与人体的每公斤体重剂量折算系数表》、《实验动物学》及《中药新药药效学研究》,中药各组实验当日冷开水配置所需动物灌胃浓度,低剂量、高剂量分别相当于临床等效药量的2、4倍。空白对照组、模型对照组和各中药治疗组每日灌胃两次,空白组和模型对照组每日灌胃蒸馏水,克龄蒙组采用相当于临床等效药量的4倍,每日灌胃1次,连续灌胃20天。针刺治疗组取穴定位参照国家规划统编教材《腧穴学》和《实验针灸学》大鼠标准穴位图定位及拟人对照法定位,取关元穴直刺约3mm,三阴交直刺3mm,头穴取百会平刺进针约3mm,各穴留针20min。每隔5min进行补法捻针。每日1次,连续治疗20天。计量如下:空白对照组(A):每日灌胃蒸馏水20ml/(kg/d);模型对照组(B):每日灌胃蒸馏水20ml/(kg/d);克龄蒙对照组(C):于动情前期和动情期每日灌胃白色片为0.83mg/(kg/d),于动情后期和动情间期每日灌胃橙色片为1.25mg/(kg/d);滋肾填精汤高剂量组(D1):每日灌胃滋肾填精汤73.33g/(kg/d);滋肾填精汤低剂量组(D2):每日灌胃滋肾填精汤36.67g/(kg/d);温肾填精汤高剂量组(E1):每日灌胃温肾填精汤72.50g/(kg/d);温肾填精汤低剂量组(E2):每日灌胃温肾填精汤36.25g/(kg/d);益肾调周法高剂量组(F1):序贯灌胃滋肾填精汤和温肾填精汤,于动情前期和动情期灌胃滋肾填精汤,动情后期和动情间期灌胃温肾填精汤,剂量同滋肾填精汤和温肾填精汤高剂量组;益肾调周法低剂量组(F2):序贯灌胃滋肾填精汤和温肾填精汤,于动情前期和动情期灌胃滋肾填精汤,动情后期和动情间期灌胃温肾填精汤,剂量同滋肾填精汤和温肾填精汤低剂量组。1.5一般情况下观察和指标确定1.5.1一般情况下每日早上8点测体重1次,观察一般生命体征、行为方式、进食状况的改变、毛色及精神状态的变化。1.5.2血浆低温离心于实验末次给药后,各组大鼠禁食24h,不禁水,用电子天平称重后,根据体重按随机数字表法各组随机抽取10只,眼眶取血1.0ml,3h内以4000r/min低温离心10min,分离血浆,于-70℃保存待测;取血后将大鼠迅速断头,取全脑、垂体和胃,入沸生理盐水中煮5min,分离出下丘脑,用玻片刮取胃窦部粘膜,分别用分析天平称重后置玻璃匀浆管内,加入1mol/L冰醋酸1ml,充分匀浆后倒入塑料试管,于室温下放置100min,加入1mol/LNaOH1ml,4000r/min低温离心10min,取上清液于-70℃保存待测,酶联免疫测定试剂盒测定血浆β-EP水平,具体操作步骤按试剂盒说明进行。1.6均数标准差的计算数据采用计算机SPSS(18.0)统计分析软件处理,计量资料所有数据以均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示。考察各个实验组与空白组及模型组比较是否存在差异时使用Donnett-t检验;考察各个实验组两两之间比较是否存在统计学意义时使用SNK-q检验。P<0.05为有统计学意义。2各组外周血-ep,主要有统计学组p型表1的结果显示,与空白组比较,模型对照组、滋肾填精汤高剂量组、滋肾填精汤低剂量组的外周血β-EP水平均明显下降,并有统计学意义(P<0.05);与空白组比较,模型对照组、滋肾填精汤高剂量组、滋肾填精汤低剂量组、温肾填精汤高剂量组、温肾填精汤低剂量组的下丘脑β-EP的含量均有降低,并有统计学意义(P<0.05);与模型对照组比较,其余各组的外周血β-EP的水平和下丘脑β-EP含量均有升高,空白组、克龄蒙组、温肾填精汤高剂量组、温肾填精汤低剂量组、益肾调周法高剂量组、益肾调周法低剂量组、针刺治疗组的外周血β-EP的水平均有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,空白组、克龄蒙组、益肾调周法高剂量组、益肾调周法低剂量组、针刺治疗组的下丘脑β-EP含量升高具有统计学意义(P<0.05);与克龄蒙组比较,模型对照组的外周血β-EP的水平降低,并具有统计学意义(P<0.05),而空白组、益肾调周法高剂量组、益肾调周法低剂量组的外周血β-EP的水平升高明显,具有统计学意义(P<0.05);与克龄蒙组比较,模型对照组、滋肾填精汤高剂量组、滋肾填精汤低剂量组下丘脑β-EP含量均降低,并具有统计学意义(P<0.05);与针刺治疗组比较,模型对照组、滋肾填精汤高剂量组、滋肾填精汤低剂量组的外周血β-EP的水平和下丘脑β-EP含量均降低,并具有统计学意义。3讨论3.1调节女性生殖功能内啡肽(endorphin)是与吗啡活性相似的高等生物体内的内源性阿片样肽,β-内啡肽(β-endorphin,β-EP)是发现最早的一种,是具有31个氨基酸残基的氨基化合物(肽)。它能与吗啡受体结合,产生与吗啡、鸦片剂一样的止痛效果并且产生欣快感,而且具有很多其它生理功能,例如调节体温、心血管、呼吸功能、甚至是情绪调节。近年来的研究又发现其与女性生殖内分泌调节相关。女性生殖功能的调节主要通过下丘脑-垂体-卵巢组成的轴线实施的,主要是通过复杂的激素网络系统的调节来实现的,而β-EP也参与了这一调节过程。大量实验证实,大鼠下丘脑视前区、腺垂体、卵巢及子宫中均含有β-EP和受体。实验证明,β-EP对GnRH的脉冲释放频率呈抑制性调节作用,但其作用机制尚待进一步研究。Sabbieti等通过体外培养蛙的垂体细胞,发现β-EP直接和垂体中的受体结合,促进LH的分泌。Gregoraszczuk等发现,β-EP也可直接作用在卵巢上,抑制孕酮的分泌。目前尽管关于POF与β-EP的关系的研究还不确切,但是通过笔者上述的实验可知,模型对照组的外周血和下丘脑的β-EP水平均低于空白组,各治疗组的外周血和下丘脑的β-EP水平与模型对照组比较均有提高,因此β-EP与POF有着密切的关系和非常重要调节作用。3.2养血性气气病阴证—益肾调周法的特色和对POF的调节机制的探讨自从1977年Basedovsky等提出了NEI网络学说以来,神经、内分泌、免疫三大系统之间的相互关系受到极大关注,西医学也走出了执着于微观世界的束缚。NET网络是一个多维的、3D甚至4D的网络结构,三大系统相互配合并且相互制约,使人体在时空上保持统一性。尽管现代医学提出NEI网络的概念,但一直缺乏调节网络的有效方法,而中医药、针灸手段因其整体和双向调节的特色,能够有效的调整NEI网络。同时,从NEI网络的调节角度来探讨中医药的疗效机制也是科学可行的一种新途径。卵巢早衰(POF)是现代医学专属名词,中医学历代文献并无卵巢早衰的专门记载,可归属于中医“闭经”、“血隔”、“血枯”、“不孕”等疾病,但从其症状及病理特点分析,归属于“血枯闭经”的范畴更为合理。中医理论认为肾藏精,为天癸之源,主生殖,为元阴元阳之所,“经水出诸肾”,“月经全借肾水施化,肾水既乏,则经血日以干涸而闭也”;历代医家多有论述认为肾精不足,元阴亏虚,冲任气血乏源,无以下注胞宫;肾阳虚弱,气化不利,或胞宫胞脉气血无以温运而致瘀阻经脉,气血不能下注胞宫,表现为经水后期或闭经;肾气不足,冲任血虚,不能凝精成孕,故致不孕,冲任不固,封藏失职,可致崩漏。《内经》云:“肾气盛,天癸至,任脉通,太冲脉盛,月事以时下,故有子”,肾气充盈是任通冲盛的基础,而冲任流通,气血畅达,适逢的候之期卵子才能顺利排出。由此,无论是肾阴虚、肾阳虚还是肾气虚,都可影响女性这一生理机制,阻碍排卵及正常的月经产生。所以,肾-天癸-冲任-胞宫这条轴线的功能失调是其发病的主要环节,而肾虚又是其本质证候,益肾乃治疗本病的关键所在。益肾调周法正是针对卵巢早衰以肾虚为本的病因病机,结合中医学对月经产生机制的认识,中医学的脏腑、气血、冲任和阴阳学说等理论和西医学月经周期中卵巢功能变化的规律,POF患者卵巢功能的特殊病理改变,根据神经-内分泌-免疫网络(NEI)调节机制,制定的中药周期疗法。拟定了滋肾填精汤和温肾填精汤、益肾调周法的涵义是滋补肝肾、平衡阴阳、疏达肝气、通调冲任、和谐气血。选方用药谨守女性月经周期的生理特点和卵巢早衰的主要病理改变,在卵泡期,阴血恢复的成长期,胞宫发挥脏而藏的功能,冲任常不足,以滋阴益肾、调补冲任为主,促进卵泡发育成熟为主,兼以活血通络,以便在重阴转阳的“的侯”阶段,促进排卵;黄体期,阴充阳长,肾阳之气渐旺,胞宫温暖待孕,应温肾壮阳,调理任督二脉,为胎孕或下次月经来潮奠定良好的物质基础。滋肾填精和温肾填精二方都以补肾药与调肝理气药共用,补肾药与调理冲任药相须,具有滋补肝肾、疏肝理脾、通调冲任、和谐气血之功,联合用药更显补而不滞、温而不燥、滋而不腻、济阴和阳之特色,完美体现了中医的“方从法出”、“法随证立”的诊治理念,故取名为“益肾调周法”。经络把人体联络成一个统一整体,经络与机体的神经、内分泌、免疫3大系统有着紧密的联系,而神经递质是枢纽物质,通过针刺调节内分泌激素的释放,针灸本身并不提供任何外源性物质,却能通过对NEI网络调节,对下丘脑-垂体-性腺轴发挥影响,在病理情况下起双向调节作用。关元为任脉之穴,并与冲脉相通,且又是任脉与足三阴经的交会穴,故针刺关元可补益冲任、理宫调经;三阴交为足太阴脾经腧穴,又是肝脾肾三经交会穴,调理肝脾肾三脏,理气活血。两穴合用,共收补益冲任、调理肝脾肾之功;百会穴,归属于督脉,通达阴阳,对于调节机体的阴阳平衡和协调性起着重要的作用。中药与针刺作用实际上是一个多靶点、多途径的,具有多维空间作用于失衡的NEI网络的过程。综合上述实验的结果可知,对于外周血β-