壳聚糖对金黄色葡萄球菌的抑菌活性研究

壳聚糖对金黄色葡萄球菌的抑菌活性研究

随着生活水平的提高，食品安全问题越来越受到重视。在食品生产过程中,为了延长食品的保质期,常需要添加防腐抗菌剂。据调查研究,人们常用的苯甲酸钠、山梨酸钾等化学添加剂具有致癌性、致畸性和易引起食物中毒等毒副作用。因而,广谱、高效、安全防腐抗菌剂的开发应用受到了人们的广泛关注。在众多抗菌物质中,经甲壳素脱乙酰基得到的壳聚糖,具有良好的生物相容性、生物无毒性和抗菌活性等特性,是一种较为理想的天然防腐抗菌剂。壳聚糖的抑菌作用在很大程度上受到本身纯度、脱乙酰度等的影响,但客观条件如壳聚糖浓度、溶剂的种类和浓度、pH值等因素也可能会对壳聚糖的抑菌作用产生影响。目前有关壳聚糖抑菌性能的研究涉及面虽极为广泛,但关于客观因素对水溶性壳聚糖抑菌活性影响的研究较少,且所得结果并不一致。本项目主要对客观因素对水溶性壳聚糖抑菌性能的影响进行研究,为水溶性壳聚糖在抑菌应用上提供科学依据。1材料和方法1.1绿神生物工程壳聚糖:水溶性,分子量为5.8×104,购自南通绿神生物工程有限公司;金黄色葡萄球菌:广州微生物研究所提供,菌种编号:GIM1.142。1.2水、电、汽、u营养肉汤培养基,营养琼脂培养基(北京陆桥技术有限责任公司);氯化镁、氯化钠、氯化钙均为分析纯(广东光华化学厂);盐酸,分析纯(广州化学试剂厂)。超纯水机LD-100G-C(重庆利迪现代水技术设备有限公司);手提式压力蒸汽灭菌器YXQ-SG46-280SA(上海博讯实业有限公司);恒温培养箱SPX-250B-Z(上海博讯实业有限公司);振荡培养箱HZQ-F160(中国哈尔滨市东联电子技术开发有限公司);可见光光度计722S(上海精密科学仪器有限公司)。1.3第2代以上菌种培养试验前将所选菌种进行传代培养,用4mm取菌环将菌种以划线法接种到营养琼脂培养基上,37℃培养箱中培养24h,并按上述操作将所需菌种培养到第3代以上。传代后用涂布棒将培养基上生长良好的菌落与少量蒸馏水混合,然后将菌液倒入灭菌冷却的液体培养基内,放入摇床内(温度为37℃、转速为100r/min)培养24h,并按照国标GB4789.2-1994稀释平板计数法,用肉汤培养基对菌悬液进行一系列的稀释,并对其进行计数,确定菌悬液达到106—107个/mL,备用。1.4单因素试验抗胆红素菌的性能1.4.1细菌数量测定分别称取0.3、0.24、0.15、0.09、0.03g壳聚糖,用50mL2%的醋酸溶液溶解,加入250mL液体培养基,使壳聚糖的浓度(W/V)分别为0.1%、0.08%、0.05%、0.03%、0.01%,用1mol/L的HCl溶液或NaOH溶液调pH至7.0。将培养基分装于试管中,每管8mL,121℃灭菌15min,冷却后用无菌移液管吸取菌悬液0.3mL加入试管中,振荡混匀;用分光光度计在610nm波长下测定试样的初始吸光度值,然后放入37℃恒温培养箱内培养。分别在4、8、12、16、20、24、28、32h后测定试样的吸光度值,以吸光度值的变化反映菌液浊度的变化,即细菌数量的变化。每个试样做3份平行样取平均值。以未加菌悬液的培养基作空白,同时设不加壳聚糖样品的培养基作为对照。1.4.2初始ph的确定各称取0.3g壳聚糖,用50mL2%醋酸溶液溶解后,加入250mL液体培养基,使壳聚糖的浓度(W/V)为0.1%,用1mol/L的NaOH溶液或1mol/L的HCl溶液调节pH为6.5、6.0、5.5、5.0、4.5。将培养基分装于试管中,每管8mL,121℃灭菌15min,冷却后用无菌移液管吸取菌悬液0.3mL加入试管中,振荡混匀,测定610nm处的初始吸光度值,然后放入37℃恒温培养箱内培养。分别在4、8、12、16、20、24、28、32h后测定试样的吸光度值。每个试样做3份平行样取平均值。以未加菌悬液的培养基作空白。1.4.3壳聚糖含量测定各称取0.3g壳聚糖,分别用50mL2%HAC—0.2mol/L的MgCl2,NaCl,CaCl2溶解后,加入250mL液体培养基,使壳聚糖的浓度(W/V)为0.1%,用1mol/L的NaOH溶液调节至7.0。将培养基分装于试管中,每管8mL,121℃灭菌15min,冷却后用无菌移液管吸取菌悬液0.3mL加入试管中,振荡混匀;测定610nm处试样的初始吸光度值,然后放入37℃恒温培养箱内培养。分别在4、8、12、16、20、24、28、32h后测定试样的吸光度值。每个试样做3份平行样取平均值。以未加菌悬液的培养基作空白。1.4.4菌液浊度的测定各称取0.3g壳聚糖样品,分别用50mL浓度为0%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%的醋酸溶液溶解后,加入250mL液体培养基,使壳聚糖的浓度(W/V)为0.1%,用1mol/L的NaOH溶液调节至7.0。将培养基分装于试管中,每管8mL,121℃灭菌15min,冷却后用无菌移液管吸取菌悬液0.3mL加入试管中,振荡混匀;测定610nm处试样的初始吸光度值,然后放入37℃恒温培养箱内培养。分别在4、8、12、16、20、24、28、32h后测定试样的吸光度值,以吸光度值的变化反映菌液浊度的变化。每个试样做3份平行样取平均值。以未加菌悬液的培养基作空白。2结果与讨论2.1单因素试验的结果分析2.1.1黄菌种抑菌性的测定图1为不同浓度的壳聚糖对抑菌性能的影响,从图中可知,菌液在610nm处的吸光度值随着壳聚糖浓度的增加而减小,即壳聚糖对金黄色葡萄球菌的抑菌性随其浓度的增加而增大。这是由于壳聚糖的抑菌性主要来源于分子链上带有正电的取代基-NH3+,因此壳聚糖的浓度越高,溶液中所含的正电的取代基-NH3+就越多,而金黄色葡萄球菌的细胞壁含有大量的磷壁酸,带有负电荷,因此溶液中的取代基-NH3+就会附在细胞膜的表面,与带负电的磷壁酸结合,改变细胞膜的通透性,扰乱了细胞的正常生理功能,从而起到抑菌的效果。2.1.2ph对壳聚糖抑菌活性的影响pH值对壳聚糖抑菌性能的影响的研究表明,pH值对壳聚糖的抑菌作用具有较大的影响(图2),当pH为5.5—6时,壳聚糖对金黄色葡萄球菌的抑菌性能最强;pH为4.5—5.0时,壳聚糖的抑菌活性相对较低;而当pH>6时,壳聚糖的抑菌活性则出现明显下降。这可能在酸性条件下壳聚糖分子中的-NH3+能与带负电荷的细胞壁发生静电吸附作用,这个过程有利于壳聚糖分子与微生物相结合,从而提高其抑菌性能。杨冬芝等也认为酸性条件下,壳聚糖作为分子吸附到细菌细胞壁上,使细胞壁和细胞膜上负电荷分布不均,干扰细胞壁合成,导致细菌裂解而死亡。而当pH<5.0时,即使不加壳聚糖,细菌的生长也会受到抑制,但是pH值过低时,会有一定量的H+也吸附在金黄色葡萄球菌细胞表面,从而抑制了壳聚糖的吸附,削弱了壳聚糖的抑菌效果。另外,当pH>6时,由于壳聚糖的溶解性和质子化程度大大降低,因此较难发挥较强的抑菌活性。2.1.3壳聚糖的阳离子检测研究表明,金属离子能在一定程度上削弱壳聚糖的抑菌性能,如图3所示,当壳聚糖溶液中含有一定量的金属离子Ca2+、Na+、Mg2+时,菌液的吸光度值比不含金属离子的菌液吸光度显著增大;并在相同的金属离子浓度下,Ca2+、Na+、Mg2+削弱壳聚糖对金黄色葡萄球菌的抑菌性能不同,3种阳离子削弱壳聚糖抑菌活性的能力顺序为Ca2+>Mg2+>Na+。这可能是因为壳聚糖能鳌合环境中的金属离子,形成盐-壳聚糖复合物从而减少壳聚糖活性电荷,造成环境中离子浓度的改变而降低了壳聚糖的抑菌活性。Young和Kauss也提出假设认为无机阳离子代替了细胞壁中的Ca2+与壳聚糖结合成稳定的复合物而阻止了壳聚糖诱导的细胞泄漏。因此当壳聚糖作为防腐抑菌剂时使用在钠、镁、钙等金属离子丰富的食品中时,应考虑其抑菌活性下降的问题。2.1.4壳聚糖的抑菌性水溶性壳聚糖溶于醋酸溶液中对金黄色葡萄球菌的抑菌性能与溶于水相比具有较大的改善。如图4所示,当醋酸浓度为2%时,壳聚糖对金黄色葡萄球菌的抑菌性能最大;醋酸浓度为1%和1.5%时,壳聚糖抑菌性相对较低;醋酸浓度为2.5%和3%壳聚糖的抑菌性也有所降低。这说明水溶性壳聚糖只有在适当浓度的醋酸溶液介质中才能具有更好的抑菌效果,这可能与氨基的质子化有关。壳聚糖氨基在不同浓度的醋酸环境中的质子化程度有所不同,-NH2+H+→-NH3+,能够与带负电性的菌体通过表面静电相互作用而发生反应,并进一步对菌体造成损害。另外当醋酸浓度太低时,壳聚糖的溶解度降低,溶液中所含的-NH3+数量也减少,从而降低了其抑菌性能。而在醋酸浓度为2.5%和3%,壳聚糖可能发生了不同程度的降解,从而使其抑菌效果有所降低。2.2壳聚糖的抑菌活性研究为了确定壳聚糖抑菌性能的最佳条件,寻找各因素之间的主次关系,根据上述单因素试验,以壳聚糖浓度、pH值和醋酸浓度做3因素3水平的正交试验(表1-2)。抑菌率计算公式:其中,Y为抑菌率(%),C0为对照菌液吸光度,C为含壳聚糖菌液吸光度。根据表1进行正交试验,并对正交试验的结果进行极差分析。由表2可知,R3远远大于其它两个极差,表明壳聚糖浓度是影响壳聚糖抑菌活性的主要因素,3个因素的影响顺序为:壳聚糖浓度影响最大,pH值次之,醋酸浓度相对较弱。在选择的3个水平中可以得到壳聚糖抑菌活性的最佳组合是A1B2C1,即将壳聚糖溶于2%的醋酸溶液中,配置成浓度为0.1%的溶液,并将pH值调节至6.0。再以正交试验确定的最佳抑菌条件进行重复验证试验,得到抑菌率为83.15%。3壳聚糖的抑菌活性本试验研究了壳聚糖对金黄色葡萄球菌抑菌活性,考察了壳聚糖浓度、pH值、金属离子、醋酸浓度的变化对壳聚糖抑制金黄色葡萄球菌活性的影响,并以浓度、pH值、醋酸浓度为因素进行正交试验,确定了壳聚糖对金黄色葡萄球菌抑菌活性的最优条件。试验结果表明,壳聚糖对金黄色葡萄球菌的抑制能力随其浓度的升高而增强;壳聚糖溶于浓度为