固定金属离子亲和色谱法imac在蛋白质分离中的应用

固定金属离子亲和色谱法imac在蛋白质分离中的应用

自1975年以来，该技术已在分离和提取蛋白质方面得到广泛应用。该法是基于蛋白质对固定在基质上金属离子亲和能力的不同进行分离,较其它亲和色谱法有许多优点:不固定金属的裸柱可作为阳离子交换剂来分离一些带正电荷的蛋白质,除去水中微量金属,对水进行净化和消毒;固定金属离子的色谱柱,在低离子强度下可作为金属螯合柱分离亲和金属的蛋白质,在高离子强度下金属螯合柱又显示疏水特性,可作为疏水柱分离不同疏水性的蛋白质;利用同一基质可制成吸附性能不同的金属螯合柱,固定金属离子的再生和更换非常容易,柱寿命长;在多数情况下蛋白质通过柱子仍保持生物活性;与其它亲和柱相比,蛋白质负载量高,容易放大和工业化。由于IMAC具有上述特点,一直受到生物色谱学家的青睐,他们在理论和应用方面都作了大量工作,其中最大的改进是应用组氨酸标记来分离重组多肽或蛋白质。本文在前人工作的基础上,结合笔者近年的研究成果,介绍了IMAC的原理、金属螯合柱的制备、蛋白质与固定金属离子的相互作用、蛋白质在金属螯合柱上的保留与洗脱以及IMAC在蛋白质研究中的应用。1金属离子的固定及利用IMAC中的固定相是由基质、络合剂和金属离子三部分组成。基质为固体用以担载金属螯合配体。作为分离蛋白用的色谱载体要求粒度小(10～300μm)、孔径大(≥30nm)、表面积大、分布均匀、刚性好、非特异吸附小、化学稳定性高。常用的基质有大孔硅胶、交联琼脂糖(sepharose)和交联葡聚糖(sephadex)以及有机聚合物TSK-gelG500PW。这些基质各有特点,硅胶较后三种有机载体刚性好、分离效率高,但在高pH下易溶解,低pH下易产生硅羟基,且柱容量低,不适于较大规模的分离纯化。TSK的机械强度虽介于硅胶和琼脂糖或葡聚糖之间,但与金属螯合配体结合不牢固,使用时金属离子易泄漏。络合剂的作用是将金属离子固定在基质上,为此络合剂既含能与基质共价键合的活性基团如—Ν=N==、—OH、—Cl等,又有能与金属离子配位的多个配位原子。为保证固定金属离子可以接受蛋白质给予的电子对,络合剂上配位原子数应小于金属离子的配位数。IMAC中常用的络合剂有亚氨基二乙酸(IDA)、N,N,N′-三(羧甲基)乙烯二胺(TED)、氮基三乙酸(NTA)、羧甲基门冬氨酸(CM-ASP)、四乙烯戊胺(TEPA)、羧甲基α,β-二胺丁二酸(CM-DASA)和乙二胺N,N′-二乙酸(EDDA)等。最近几年开发了一些新的不含羧甲基胺的络合剂,如染料——耐黄2KT、O-磷酸丝氨酸和8-羟基喹啉等。其中IDA应用最广,这是由于IDA是一种三齿络合剂,它既能同金属离子形成稳定的金属螯合物,防止色谱过程金属离子的泄漏,又使金属离子在螯合后留下足够能与蛋白质强烈结合的配位点。IDA适中的亲水性也为蛋白质的分离提供了温和的环境。固定金属通常为具有d层空价电子轨道的过渡金属如Cu2+、Ni2+、Co2+、Zn2+、Fe3+等,它们与络合剂形成可与蛋白质结合的金属螯合配体。为了将金属螯合配体固定在选择的基质上,连接前必须用活化剂将基质活化,使其末端具有能与络合剂共价键合的活性基团如环氧基。硅胶常用的活化剂为γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷,对有机载体常用环氧乙烷如表氯醇进行活化。制备金属螯合柱时,通常先用化学方法使活化基质与络合剂键合成具有阳离子交换特性的裸柱,然后灌注选用的金属离子,待吸附达到饱和,用平衡缓冲液除去过剩的金属离子,即制成所需要的金属柱。如要更换新的金属离子,可用乙二胺四乙酸(EDTA)除去旧的金属离子,重新注入新的金属离子。可以看出,IMAC实质是把蛋白质与金属离子在液相中的均相反应转移到固液两相间进行。经过如此改进,反应的热力学和动力学性质将发生改变;减小了蛋白质与金属离子在液相作用的自由度,避免了蛋白质的变性;使分散在溶液中的蛋白质得到富集和分离。2其他结构的蛋白质保留的作用蛋白质在IMAC中的保留机理至今还没有一个定论,多数学者认为蛋白质在固定相的吸附是静电、疏水和配位作用的总和。所谓配位作用是蛋白质表面富电子的给予基(如—NH2、—S-和—COO-)将其孤对电子插入固定金属离子d层空价电子轨道形成配位键;静电作用是带电金属螯合配体与带电蛋白质分子间以及近距离范围带电配位原子与固定金属离子电荷间的相互作用;疏水作用是固定相疏水碳链与蛋白质表面疏水区域的亲和作用,这种作用随溶液盐浓度的增加而增大。这三种作用力在不同条件下对蛋白质的保留贡献大小不一,常随流动相、固定相和蛋白质的性质发生变化。在高盐浓度的流动相体系,根据疏溶剂理论,随着盐浓度的增加,溶液表面张力增大,蛋白质与金属螯合柱间的疏水作用增强,此时支配蛋白质保留的作用力不是静电和配位作用,而是疏水作用。然而在正常的IMAC体系中盐浓度较低(NaCl≤0.5mol/L,(NH4)2SO4≤0.25mol/L),疏水作用对蛋白质保留的影响不很显著,这时决定蛋白质保留的作用力主要为静电和配位作用。根据蛋白质在金属螯合柱上的保留特征,可以把常见的金属柱分为两类:与蛋白质强烈亲和的IDA-Cu柱和对蛋白质结合较弱的IDA-Ni、IDA-Co、IDA-Zn柱。对强结合的IDA-Cu柱支配蛋白质保留的主要作用力为配位作用,静电作用为辅,这从表1的实验事实可以得到证明。表1中所有试验蛋白不被离子交换常用的NaCl-磷酸缓冲体系洗脱,说明蛋白质和固定金属离子间的结合主要不是静电作用,而是结合较强的配位键。用含纯粹竞争洗脱剂(His和Gly)的磷酸缓冲体系,蛋白质也不被洗脱,说明蛋白质和固定金属离子间的作用也不是单一的配位作用。仅在其中加入NaCl后蛋白质才被洗脱,表明蛋白质和金属离子间除配位作用外,还有静电作用。NaCl削弱了蛋白质与固定金属离子间的静电作用,而竞争洗脱剂对固定金属离子的竞争配位破坏了蛋白质与金属螯合配体间的配位作用。如果把蛋白质在弱结合金属柱IDA-Ni、IDA-Co、IDA-Zn上的保留行为与不固定金属离子的IDA裸柱进行比较,发现蛋白质在弱结合金属柱上仍保留IDA裸柱阳离子交换特性。例如蛋白质可用含NaCl的磷酸缓冲体系洗脱,蛋白质保留值随等电点(pI)的增加而增大,保留值对pH变化较敏感,说明蛋白质和金属螯合配体间具有静电作用特征。另一方面,蛋白质在弱结合金属柱上也增加了新的色谱行为,例如金属离子的插入使蛋白质保留值发生改变,蛋白质对pH的依赖关系与裸柱正相反,在裸柱上蛋白质保留值随pH的增加而减小,而在弱结合金属柱上随pH增加保留值趋于增大(表2)。这是由于随着pH的增加蛋白质和固定金属间配位作用增强的缘故。总之,高盐浓度下蛋白质在IMAC中的保留是疏水、静电和配位的协同作用,其中以疏水作用为主。在低盐浓度色谱体系蛋白质与固定相间主要是静电与配位作用;对强结合的IDA-Cu柱蛋白质与固定相间以配位作用为主,静电作用为辅;对弱结合的IDA-Ni、IDA-Co、IDA-Zn柱,蛋白质与固定相间以静电作用为主,配位作用次之,但随溶液pH的增加配位作用随之增大。3金属离子和蛋白质表面配体的选择影响蛋白质与金属螯合柱作用的因素很多,主要有金属离子和蛋白质表面配体的性质、溶液pH、离子强度和其它竞争配体等,搞清这些问题对提高分离的选择性和选择适宜分离条件非常重要。3.1cu对蛋白质晶场的影响当同一蛋白与不同金属作用时,由于金属离子所带电荷、离子半径和电子层结构的不同,对蛋白质呈现不同的亲和力。IMAC中常用的几种金属离子Cu2+、Ni2+、Zn2+和Co2+具有相同电荷,其离子半径分别为69、72、74和74pm。半径越小,配位作用越强,与蛋白质形成的络合物越稳定。因此,Cu柱对蛋白质具有最强的结合力,Co和Zn柱结合最弱。除离子半径外,络合物的稳定性也受配位原子对中心离子外层d轨道的影响。根据配位化合物晶体场理论,蛋白质表面的配位基如组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基、色氨酸的吲哚基通常可以看作弱场强配体。当这些基团与Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+配位时,中心离子的d电子分布发生改变,其晶体场稳定化能(CFSE)如表3所示。从表3可知,Cu2+配位化合物稳定化能最低(-12.3Dq),加之Cu2+半径最小,因此对蛋白质配位最强,Ni2+次之,Co2+和Zn2+最弱,这个顺序与蛋白质在金属螯合柱上的保留顺序一致。应当指出,与蛋白质结合最强的金属离子未必能使蛋白质得到最好分离,因为较强的结合往往也使杂质的吸附增加。3.2蛋白质表面氨基酸的结构变化配位体对金属络合物稳定性的影响,还包括配位氨基酸的类型、数目、离解常数和空间取向。从理论上讲,蛋白质表面氨基酸残基中的α-氨基和羧基以及侧链上电子给予基都能参与同固定金属的配位。但由于侧链上的配位原子具有较大空间自由度,可以充分与固定金属接近,因此,在金属螯合色谱中侧链上氨基酸残基对金属离子的结合较末端氨基和羧基更为重要。侧链上的配位原子,就其酸碱软硬性可分为三类:配体中的氧原子、脂肪族氮和三价磷属硬碱;芳香族氮为交界碱,而硫是软碱。根据软硬酸碱规则,Cu2+、Ni2+、Zn2+和Co2+是交界酸,它们优先同属交界碱的芳香族氮和软碱硫原子配位。因此,组氨酸中的咪唑基、色氨酸中的吲哚基和半胱氨酸中的巯基是蛋白质中与金属络合最强的配基,其中以组氨酸最为重要。而属于硬碱的羧基和磷酸基优先同硬酸金属离子Fe3+和Mg2+配位。配位作用强弱,除配位体的性质外,也与配位氨基酸残基的数目、离解常数和空间取向有关。通常蛋白质表面组氨酸数目越多,离解常数越大,配位原子中孤对电子取向与金属离子中空价电子轨道伸展方向越一致,蛋白质与金属螯合配体越容易成键。表4给出RNase、Cyt-C、Lys和BSA表面氨基酸的分布情况。单从蛋白质表面组氨酸的数目来看,蛋白质在同一柱上的流出顺序应为Lys、Cyt-C、RNase和BSA。但经X射线结构分析可知,RNase表面的两个组氨酸残基处于蛋白质表面的不同位点,105位的组氨酸(H105)很容易接近固定金属,而H119难以接近,所以RNase表面有效配基数与Lys、Cyt-C相当。但由于RNase的pI低于Cyt-C和Lys,在实验pH条件下,蛋白质分子正电性较低,所以在弱配位的金属螯合柱上仍然先被流出。Cyt-C与Lys相比,在Cyt-C表面仅含一个可接近的H33,而在Lys表面除有一个H15外,还有两个辅加的62位和123位的色氨酸残基。另外LysH15的离解常数(KC=6.3×10-6)大于Cyt-CH33的离解常数(KC=3.2×10-7),因此Lys与固定金属具有较强亲和力,洗脱时最后流出。BSA表面虽含2个组氨酸,但因pI较低,在操作pH下蛋白质带负电,与负电性的螯合配体相互排斥,应最先流出。3.3ph对蛋白质洗脱的影响pH在蛋白质吸附与解吸中的作用相当复杂,因为它不仅涉及缓冲体系成分的亲核行为,也影响电子给予体和接受体的性质。表2是蛋白质在IMAC中保留值与pH的关系。从表2看出,随着溶液pH的增加,蛋白质在金属螯合柱上的保留值有增大趋势。产生这种现象的原因,是由于随着pH的增加,蛋白质表面配位原子质子化的程度减弱,与固定金属离子的配位作用增强;另一方面,随pH的增加,配位原子负电性增大,与带正电荷的金属离子在近距离范围的静电作用增强。因此在IMAC中蛋白质保留值随pH增加而增大。利用保留值与pH的这种关系,可以通过减小溶液pH达到洗脱蛋白的目的。事实上随着pH的减小,溶液中质子开始同金属离子竞争结合蛋白质表面配体—NH2、—S-和—COO-,降低了配体与金属离子结合的能力;再者,质子化氨基上的正电荷开始排斥带正电荷的金属离子,—S-和—COO-的质子化削弱了对金属离子的吸引力,使得蛋白质与固定金属离子的结合物变得更不稳定,于是蛋白质得到洗脱。IMAC中调节pH常用的缓冲液是磷酸盐和醋酸盐体系。为防止蛋白质变性、避免硅胶溶解和硅羟基的形成并有利于蛋白质的吸附,溶液的pH通常控制在6.0～8.0。3.4其他柱的洗脱实验证明,固定金属离子的IDA柱具有两种色谱功能。在低盐浓度可作为金属螯合柱,而在高盐浓度又可作为疏水柱,并且这两种功能随流动相中盐浓度发生改变。当用低浓度盐的缓冲液作流动相(NaCl<0.5mol/L),除强亲和性的IDA-Cu柱外,吸附在弱亲和性IDA-Ni、IDA-Co、IDA-Zn柱上的蛋白质利用增加盐浓度的方法都可以被洗脱。这是由于低盐浓度时,支配弱亲和金属柱与蛋白质的作用力为静电作用。随着盐浓度的增加,由于屏蔽效应而使带相反电荷的金属离子与蛋白质间的静电作用减弱,故蛋白质的保留值随盐浓度增加而减小。但对与蛋白质强结合的IDA-Cu柱,由于支配固定相与蛋白质作用的力为配位键,因此用增加盐浓度的方法不能将吸附蛋白洗脱,仅用与蛋白竞争结合金属离子的竞争洗脱剂才被洗脱。在高盐浓度(NaCl>0.5mol/L,(NH4)2SO4>0.25mol/L)IMAC的保留行为类似HIC,支配蛋白质在固定相吸附的作用力是疏水作用。因此吸附在固定相的蛋白质可利用疏水色谱中常用的减小盐浓度的方法被洗脱。但对强亲和性的IDA-Cu柱,由于蛋白质与Cu2+间的强配位作用,即使利用降低盐浓度的方法也不被洗脱,仅通过竞争洗脱才能破坏蛋白质与固定Cu2+间的结合。3.5流动相中竞争金属离子的吸附与金属螯合柱强烈结合的蛋白质,有时用降低pH和改变离子强度的方法不能将吸附的蛋白洗脱下来,这时可以在流动相中加入能与被吸附蛋白竞争结合固定金属离子的竞争洗脱剂如组氨酸、甘氨酸、咪唑和氨等,利用竞争洗脱剂与固定金属离子竞争配位作用,将吸附在固定相上的蛋白置换下来。也可以使用与固定金属离子同时竞争结合被吸附蛋白的竞争剂。由于流动相中竞争洗脱剂与固定金属离子间有较强的配位作用,往往易造成固定金属离子的泄漏,尤其使用强配位的EDTA。为了减免这种现象,使用的竞争洗脱剂配位强度和浓度要适当,也可以在流动相加入少量固定金属离子以抑制金属离子的流失或在金属柱后串联一支IDA裸柱,除去泄漏的金属离子以免污染系统和产品。综上所述,在高离子强度的流动相中,金属螯合柱显示疏水性能,可用减小盐浓度的方法洗脱蛋白质。在低离子强度的金属螯合色谱体系,可用减小pH或增加盐浓度的方法洗脱。对用这两种方法都不能洗脱的一些强结合蛋白,可按竞争洗脱方法进行。为了提高分离的选择性,有时在流动相中加入少许去污剂如Tween80,以消除干扰。加入甘油和蛋白酶抑制剂可以维持酶的活性。加入2-巯基乙醇可防止蛋白质聚集。为使各种蛋白质在最佳pH、离子强度和竞争洗脱剂浓度下被洗脱,洗脱方式多按分段或梯度进行。4生物材料研究中的imaIMAC在生物大分子研究中的应用主要集中在两方面:蛋白质的识别和分离纯化。4.1蛋白质表面his的分布与分布Chicz等利用IMAC作为探针来区分天然均一蛋白及其变种,并将这种技术扩展到基因工程,用以识别蛋白质表达错误。此法的依据是当蛋白质突变发生一位或多位氨基酸取代时,必然影响其表面组氨酸与固定金属离子的作用,导致蛋白质保留值发生变化,根据保留值的变化判断蛋白质遗传过程表达的正确性。他们把野生枯草杆菌蛋白酶同一位或多位取代的枯草杆菌蛋白酶变种的保留值进行了比较,发现无论一位或多位取代都使天然蛋白酶的保留值发生明显变化,并且变化的大小与取代的氨基酸性质有关。如在pH6.2用中性氨基酸取代Gly166位点,蛋氨酸(Met)给出最大保留值,缬氨酸(Val)给出最小保留值。在pH6.2用带电氨基酸取代Gly166位点,His给出最大保留值而谷氨酸(Glu)给出最小保留值。导致突变后蛋白质保留值变化的原因,可能由于一位或多位取代引起蛋白质表面His64与固定金属离子作用的微环境发生变化。Sulkowski根据不同金属离子配位需要His数目的不同,提出利用金属螯合柱识别蛋白质表面His的分布,并建立了His的拓扑图。从表5看出,当蛋白质通过金属螯合柱时,仅在IDA-Cu柱保留,而不在IDA-Ni、IDA-Co、IDA-Zn柱保留,表明蛋白质表面仅有一个可与固定金属离子配位的His。若蛋白质仅被IDA-Cu和IDA-Ni保留,而不被IDA-Co和IDA-Zn保留,表明蛋白表面His的分布为—His(Xn)His。若蛋白质在上述四种金属螯合柱都保留,表面His的分布可能为—His(Xn)His(n(2,3);α-螺旋)和—HisHis—。除了上述应用外,近年也出现一些与IMAC相关的新技术如生物传感器、固定金属亲和毛细管电泳(IMACE)以及固定金属亲和色谱-质谱联用(IMAC-MS),用以检测样品中分析物。4.2亲和色谱法检测用IMAC分离纯化蛋白质常用三种方法:直接色谱法(DC-IMAC)、螯合肽-固定金属亲和色谱法(CP-IMAC)和叠层亲和色谱法(CSAC)。4.2.1imac与双水相萃取的分离纯化DC-IMAC是利用被分离蛋白与固定金属离子的亲和作用直接进行色谱分离,这是IMAC中最常用的一种方法。按此方法分离的蛋白有许多种,样品主要来源于人、动物、植物组织、器官和体液以及生物发酵液和培养液。主要工作有:人血清中清蛋白、α-胰蛋白酶抑制剂、糖蛋白、转铁蛋白和免疫球蛋白的分离与鉴定;人血浆中凝血因子、血纤维蛋白原、α2-巨球蛋白和α1-蛋白酶抑制剂、α1-巯基糖蛋白、α1-巯基蛋白酶抑制剂的分析;人血中超氧化物歧化酶、血型糖蛋白、血小板生长因子、人蛋白和钙结合蛋白、人及动物和大肠杆菌中干扰素的测定;猪滑液和动物组织培养液中胶原酶、猪结肠肠胃多肽、猪乳中胰蛋白酶抑制剂、狗心肌红蛋白、鼠肝中核苷二磷酸、鼠腹水中单克隆IgG、鸡胸中糖原磷酸酶和乳酸脱氢酶、兔骨金属蛋白酶、兔肾酪氨酸磷酸酶、牛奶中α-乳清蛋白、大豆中脂肪氧化酶、麦芽中α-淀粉酶、生长激素和催乳激素、西红柿蔗糖合酶异构物、发酵液中苹果酸脱氢酶等的分离纯化。在基因工程产品的分离纯化中,近几年一些生物化学家也将IMAC技术用于变性蛋白的再折叠,通过色谱过程中的稀释、去变性剂和交互折叠等作用,使胍变或脲变蛋白在金属螯合柱上得到复性。例如用Ni(Ⅱ)-NTA柱复性的蛋白有:哺乳动物蛋白、DNA螺旋酶、人源抗HBsAg单链抗体、外聚磷酸酶等。这个方法对基因工程中存在于包含体内重组蛋白的复性非常有用。它较常规复性方法操作简单,一次可同时完成分离、去变性剂和复性等步骤,蛋白质的错误折叠较少,复性效率高。为进行大规模纯化,Clemmitt等和Willoughby等把IMAC和扩张床吸附色谱(EBA)结合起来,利用金属螯合填充物对被分离蛋白的选择性亲和和扩张床的流态化性能,可直接从发酵液或动植物培养液中分离出目标蛋白。Sivars等把IMAC扩展到双水相萃取体系,用金属-聚乙二醇作为其中一相,溶于水的高分子化合物或盐溶液作另一相,利用固定金属离子对蛋白质的选择亲和及蛋白质在两相中分配系数的不同进行分离。由于这两种方法可直接分离未经澄清的样品,因此在分离细胞碎片和胞内蛋白质具有很大潜力。4.2.2化学或酶法纯化通常在蛋白质里His的含量较少,约占球形蛋白氨基酸总量的2%,并且仅有一半暴露在蛋白质的表面,其中可与固定金属离子接近的有效His为数更少,因此自然界仅有部分天然蛋白质拥有金属亲和性。为了扩大IMAC的应用范围,Smith等根据重组肽对固定金属离子有强亲和能力,建立了CP-IMAC,此法是利用融合技术先将对固定金属离子有亲和力的螯合肽连接到被纯化蛋白的C-或N-末端,制成对固定金属离子有亲和力的融合蛋白。经IMAC分离后,再用化学或酶法断裂技术除去融合蛋白中的螯合肽,即得高纯度目标产品。例如Hochui等为了纯化鼠二氢叶酸还原酶,先使鼠二氢叶酸还原酶与多His螯合肽融合,然后用Ni(Ⅱ)-NTA柱分离,得到足够纯的融合蛋白,再用羧肽酶A除去末端的螯合肽。