组织脱水过程中脱脂方法的研究

组织脱水过程中脱脂办法的研究Thestudyofhowtoremovefatduringtissuedehydration丁伟1#，周立新2#，唐巍2，应李雄1，姚洪田1，张淼2，唐蒙蒙1，张晟2摘要：在病理常规解决中富含脂肪的组织经常会出现脱水、透明不佳，造成制片不全、质量较差，切片困难等现象。乙醇和二甲苯被认为在组织解决环节起到脱水及透明的作用，但在传统流程中的实际效果往往不佳。我们通过把传统脱水、透明流程中使用的无水乙醇、二甲苯液改为无水乙醇、二甲苯液等量混合液进行脱水、脱脂、透明，获得了令人满意的效果。核心词：组织解决、脱脂、无水乙醇、二甲苯、无水乙醇二甲苯混合液病理组织制备环节中脂肪的解决始终是比较困难的事情，在传统观念中认为高浓度酒精含有一定的脱脂作用。当解决含有大量脂肪组织的时候建议延长高浓度乙醇的解决时间，以期得到好的成果，但最后往往不能令人满意。二甲苯始终被认为是一种媒介试剂，二甲苯既能与乙醇混合，又能溶解石蜡，因此在其间起到置换乙醇，接引石蜡的媒介作用，在这一过程中组织块内的乙醇最后被二甲苯所取代。我们通过对乙醇和二甲苯在组织脱水、脱脂中作用的研究，并在浙江大学医学院附属第一医院和北京大学肿瘤医院2个单位同时进行实验认证，采用无水乙醇与二甲苯1：1混合的方式进行组织解决，运用乙醇与二甲苯协同作用，脱水、脱脂共同进行，得到了满意的成果，现介绍以下。1.材料和办法：1.1试剂和设备：75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、二甲苯，达科为全封闭脱水机，樱花全封闭脱水机，克拉泰切片机，徕卡2235切片机。1.2材料：通过提取的猪油；不同部位的手术标本组织；脱水机内通过试剂及沉淀物。基金项目：科技部数字诊疗装备研发课题（YFC0114104）1.浙江大学医学院附属第一医院；2.北京大学肿瘤医院#第一作者、通讯作者丁伟，浙江大学第一附属医院病理科周立新，北京大学肿瘤医院病理科1.3办法：1.3.1实验一：取相似份量提炼的动物脂肪（猪油），分别加入95%乙醇、无水乙醇和二甲苯，观察猪油不同时间段的变化状况。1.3.2实验二：将富含脂肪的人肠系膜及结肠组织经10%中性缓冲福尔马林固定16小时后，直接放入75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、二甲苯、无水乙醇和二甲苯（1:1）混合液中，放置最长24小时，观察组织以及试剂的变化。1.3.3实验三：将286块带脂肪的人体胃肠组织、乳腺组织手术标本一分为二，二分之一按照75%乙醇60分钟、85%乙醇60分钟、95%乙醇（I）120分钟、95%乙醇（II）120分钟、无水乙醇（I）60分钟、无水乙醇（II）60分钟、二甲苯（I）45分钟、二甲苯（II）45分钟传统流程解决。另二分之一按照75%乙醇60分钟、85%乙醇60分钟、95%乙醇（I）120分钟、95%乙醇（II）120分钟、无水乙醇60分钟、无水乙醇+二甲苯（1：1）60分钟、无水乙醇+二甲苯（1：1）45分钟、二甲苯45分钟改良流程解决。对2种解决流程解决的组织进行石蜡包埋，常规切片，以脂肪组织切片的完整与破损作为评分原则，进行切片质量比较。1.3.4对传统及改良流程中95%乙醇、无水乙醇、无水乙醇+二甲苯（1：1）的沉淀物进行油红O染色。1.3.5统计前一种月采用传统办法解决的日常工作切片质量与采用改良办法后一种月日常工作的切片质量，评分原则采用用等级医院检查原则。1.3.6对改良流程中95%乙醇、无水乙醇、无水乙醇+二甲苯（1:1）试剂内的沉淀物进行微谱分析。2.成果2.1实验一：猪油倒入二甲苯10秒内就被彻底溶解；倒入95%乙醇的猪油，浸泡48小时后，无明显变化；倒入无水乙醇的猪油，浸泡48小时后，外表略干燥，并出现少量细小的颗粒悬浮在试剂里（见图1）。2.2实验二：固定充足的富含脂肪人肠及系膜组织分别放入75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、二甲苯、无水乙醇+二甲苯（1:1）混合液24小时后，肉眼可见组织在75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇无明显变化；倒入二甲苯的组织，组织里的水将二甲苯隔离开来，产生乳白色的油水隔离膜；而放入无水乙醇+二甲苯（1:1）混合液的组织开始出现透明状（见图2）。2.3286块带脂肪的人体胃肠组织、乳腺组织采用传统与改良流程的切片质量，见附表1：附表1：286块带脂肪的人体胃肠组织、乳腺组织采用传统与改良流程的切片质量比较质量办法胃（72块）肠（134块）乳腺（80块）总计完整破损完整破损完整破损完整破损传统办法264653613941118（41.26%）168（58.74%）改良办法6571268737264（92.31%）22（7.69%）2.4统计采用传统及改良二种办法在日常工作中一种月的切片质量，见附表2。附表2：二种不同办法在日常工作中的切片质量办法成绩传统办法（16549块）改良办法（15465）优秀16232（98.08%）15376（99.42%）良好317（1.92%）89（0.58%）合格00不合格002.5改良流程解决的组织蜡块在日常切片时，比传统流程处的组织蜡块明显好切，且切片平整，容易连片，蜡块不内陷。2.6沉淀物的油红O染色：传统流程85%乙醇、95%乙醇第I道表面有油滴浮在上面，而沉淀为少量的白色颗粒（油红O不着色）、95%乙醇第II道白色粗颗粒沉淀（油红O着色）、无水乙醇第I道白色细颗粒（油红O着色）、无水乙醇第II道白色细颗粒沉淀（油红O着色）。改良流程无水乙醇以前（包含无水乙醇）的成果和传统流程相似，但无水乙醇+二甲苯第I道和第II道刚开始使用时，肉眼无沉淀物产生（离心后液体有少量油红O着色），解决到1800块左右组织后，黄色细颗粒状沉淀开始出现（油红O着色），并且增加速度明显，其量明显多于无水乙醇产生的沉淀；到3000块左右组织时，无水乙醇+二甲苯第II道也开始出现大量沉淀（油红O着色）（见图3）。2.6微谱检测成果：沉淀物均为饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸，详见附表3组分名称作用95%乙醇质量含量/%无水乙醇质量含量/%无水乙醇+二甲苯质量含量/%十四酸/C14:0饱和脂肪酸0.9280.8860.911棕榈酸/C16:0饱和脂肪酸17.31313.17417.502硬脂酸/C18:0饱和脂肪酸3.413.2023.835油酸/C18:1n9c不饱和脂肪酸43.8536.41943.075亚油酸/C18:2n6c不饱和脂肪酸18.35314.19919.917亚麻酸/C18:3n3不饱和脂肪酸0.6850.6940.906二十酸/C20:0饱和脂肪酸0.4550.3024.607二十烯酸/C20:1不饱和脂肪酸4.70310.1535.224二十烯/C20:2不饱和脂肪酸0.4290.710.68二十二烯酸/C22:1n9不饱和脂肪酸3.49212.2944.023附表3：95%乙醇、无水乙醇、无水乙醇+二甲苯沉淀物内成分检测3.讨论组织前解决中固定、脱水、脱脂都是比较重要的环节，脱水过程中组织样本应充足的脱水和脱脂，否则石蜡不能渗入组织从而起到较好的支撑作用，技术人员无法切出完整的切片。切片后的蜡块与空气接触，组织内的水份挥发而产生凹陷、干涸，不利于患者后继检测以及蜡块的长久保存。乙醇是一种较好的固定剂和脱水剂，运用“相似相溶原理”将组织内的水分置换出来。组织经充足固定后，乙醇在组织解决环节重要起到的是脱水作用，而二甲苯起到透明作用[1]，我们始终认为乙醇在组织解决过程中起到脱脂的作用[2]，然而，我们通过对提炼动物脂肪（猪油）在乙醇和二甲苯内的体现，证明真正起到溶解脂肪的试剂是二甲苯。二甲苯是由45%～70%的间二甲苯、15%～25%的对二甲苯和10%～15%邻二甲苯三种异构体所构成的混合物。能与无水乙醇、乙醚和其它许多有机溶剂混溶是非极性溶剂，脂肪不溶于水易溶于乙醚、氯仿、苯等非极性溶剂中，因此，与我们的实验成果相符。在组织解决过程中，乙醇通过渗入逐步脱去取材组织内的水，当乙醇浓度低时，液体含水量高，组织表面的脂肪被洗涤浮在液体的表面，当组织进入高浓度乙醇（95%以上）后，通过乳化作用，将组织内少量脂肪酸置换出组织，悬浮在脱水试剂里，这些颗粒静止时就沉淀下来，随着乙醇浓度增加和脱水时间的延长，颗粒干燥、脆裂变小，当组织进入二甲苯后，脱水干净的脂肪被溶解成肉眼看不见的细小颗粒弥散在二甲苯里。我们把95%乙醇I、95%乙醇II、无水乙醇、无水乙醇+二甲苯悬浮液进行离心，对离心后的沉淀物分别进行油红O染色，其成果95%乙醇II、无水乙醇、无水乙醇+二甲苯沉淀物为阳性，证明均为脂肪，沉淀物的微谱检测成果也证明了这一点。如果组织内含有水，我们通过实验二发现这类组织就是长时间浸在二甲苯里，二甲苯也不能渗入到组织里，更无法将脂肪溶解。这就解释了在日常工作中，由于乙醇在油脂中渗入速度比其它组织的渗入速度要慢的多[3][4]，在有限的组织脱水时间里（需要在规定的时间内完毕），往往会造成较厚的组织或含脂肪的组织脱水不彻底，组织内残留的水份，妨碍了二甲苯有效的渗入到组织内溶脂或替代乙醇的作用，造成组织浸蜡不充足，难以切片。有作者提出在二甲苯透明前，使用乙醇与二甲苯液解决30分钟能够使脱水变的彻底[5]。当使用了无水乙醇和二甲苯混合液后，二甲苯能够将脱水干净的外表脂肪快速溶解，从而增进无水乙醇的渗入，无水乙醇与二甲苯协同交替作用，达成一边脱水一边溶脂的功效，使脂肪或有脂肪包裹的组织得到从分的脱水与透明，确保石蜡有效的浸透，切片的完整性明显提高（见图4、5、6）。在实验组286块脂肪组织切片中，完整性从41.26%提高到92.31%，固然，这也有一定的极限，过厚或固定不充足的脂肪组织也无法得到完美的解决,约占7.69%。另不含脂肪的取材组织，也由于这一改良流程脱水、透明充足，即使切片质量在镜下无明显差别，但在切片过程中薄、平整、更容易切。在日常工作评分原则中，周边脂肪的切片不全，对切片优片率的评分影响不大，但总体切片的优片率还是从98.08%上升到99.42%。由于组织脱水充足即使长时间浸泡在二甲苯中，并不会出现组织发硬、发脆的现象[6]，因此，我们认为将分别使用乙醇、二甲苯液传统流程改为以等量混合使用乙醇-二甲苯液进行脱水流程更科学，合用于日常工作中组织样本的常规解决。感谢北京安贞医院病理科王伟老师予以本文指导。（本文为中国研究型医院学会病理专委会技术学组共同研究的课题）。图1相似份量的猪油分别加入95%乙醇、无水的乙醇、二甲苯5秒时的现象图2相似份量的猪油分别加入95%乙醇、无水的乙醇、二甲苯48小时后的现象图3人肠系膜脂肪组织及结肠组织通过充足固定后直接放入75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、二甲苯及无水乙醇和二甲苯混合液中，解决24小时后的状况图4解决了4200块组织后，50ml液体内的沉淀物量图5油红O染色的成果图6人肠系膜脂肪组织及结肠组织通过充足固定后梯度脱水，传统办法解决后脂肪组织中间不透明图7改良办法解决后脂肪组织透明度好图8传统流程解决的脂肪组织HE染色，脂肪有破损图9改良流程解决的脂肪组织HE染色，脂肪切片较为完整图10用改良办法解决后的淋巴结切片扫描全图图11用改良办法解决后的胃组织切片扫描全图参考文献：1.王泊沄，李玉松，黄高升等.病理学技术[M].人民卫生出版社，.2．