细胞培养污染的途径危害及预防措施

细胞培养污染的途径、危害及防止方法污染是细胞培养技术中面临的重要问题。由于每一种细胞有其独特的培养体系，因此污染造成的后果也不尽相似。某些污染的发生往往难以察觉和检测，并且污染源能长久共存于培养体系中，这类污染事实上大部分被人们无视了。培养的细胞作为一种生物体，会对培养环境以及环境中的污染物作出对应的反映，造成培养细胞生物学特性的变化，而对实验成果造成潜在的威胁，并且随着污染时间的延长而增加。培养环境中的物理、化学及生物因素都可能侵入培养环境造成污染。由于入侵的微生物在培养体系中不停增殖、代谢，因此生物性的污染对细胞的危害最大。随着污染微生物的不停增殖，交叉污染的可能性也不停增加。另外，微生物代谢消耗大量必需的养分，同时产生多个有毒的代谢产物，如酶、抗原及毒素等，进一步对细胞产生毒害作用。因此，认识细胞培养污染的途径及其危害性，建立细胞培养规范的操作办法及规章制度，能够有效地避免污染，确保明验体系的稳定性和可靠性。1细胞培养基本技术为了减少污染对细胞培养的影响，必须建立细胞冻存库。细胞冻存库应当分主细胞库（Mastercellbank，MCB）和工作细胞库（Workingcellbank，WCB），当需要做实验时从主细胞库中复苏细胞建立工作细胞库。每一种冻存标本都应明确统计细胞的性质、代数及有无污染。同时还应建立规范的检测程序进行菌检及细胞鉴定［1］。为了确保培养细胞系的完整性，必须进行具体的实验统计，应涉及下列内容：细胞系的种类及来源、有无污染（如细菌，病毒，支原体）、细胞代数和倍增时间、以及选择性突变。具体的统计有助于对细胞的遗传及生理特性在常规传代培养中因突变、污染及多个因素造成的变化进行分析。通过持续传代培养的细胞与它较早代数的冻存细胞相比，随着培养时间的延长，细胞在适应环境的过程中，其生物特性已发生了变化。培养的细胞由若干生长速度及活力各异的亚群构成。随着培养时间的延长，生长速度快及活力高的细胞亚群逐步占优势，这种选择性趋势会影响整个细胞群的生物特性。应用不同代数的细胞持续进行实验则成果会发生偏差。建立细胞冻存库就能避免这种影响，通过复苏相似代数的细胞，人们就能在较为均一的条件下重复实验。细胞培养工作需要清洁，保持良好的环境及规范的操作程序［2，3］。超净工作台是细胞培养中普遍使用的无菌操作装置，它需要合理的布置及经常性的维护。超净工作台的工作原理是驱动经高效滤菌净化后的空气，通过工作台面形成气流屏障，从而制止外界污染物的侵入并使操作过程中产生的飞沫限制在超净工作台中。由于操作过程中可能产生有毒的物质，因此采用垂直气流比水平气流安全。当进行移液，倾倒液体的操作过程会产生飞沫，并沉积在超净工作台内物体的表面。超净工作台的气流并不能制止飞沫的产生，飞沫会随着气流的方向飘浮。超净工作台不合理的放置、不恰当的维护以及不规范的使用会破坏超净工作台气流的方向，造成飞沫更广泛的沉积。酒精灯的火焰、操作者的活动、谈话、咳嗽及打喷嚏都有可能影响气流。飞沫的沉积是造成超净工作台内物品污染的重要因素，造成潜在污染的进一步传输。因此为减少交叉污染的发生，应尽量减少超净工作台内的物品。不同细胞系以及同一种实验室不同操作者所使用的培养试剂一定要分开使用，如胰酶、培养液等。否则，一种操作者的失误可能引发全部细胞发生污染。2细胞培养的污染细胞培养污染是指培养环境中侵入了对细胞生存有害的成分和造成细胞变异的异物。细胞培养污染可分为下列三类：物理性、化学性及生物性［2，3］。为了使细胞培养的成果更可靠，应当固定全部培养条件，并确保其重复性。2.1物理性污染的来源、危害及防止物理性污染经常被人们所无视或被笼统地归为化学性污染。物理性污染通过影响细胞培养体系中的生化成分，从而影响细胞的代谢。培养环境中的物理因素，如温度、放射线、振动、辐射(紫外线或荧光)会对细胞产生影响［2］。细胞、培养液或其它培养试剂暴露于放射线、辐射或过冷过热的温度中，能够引发细胞代谢发生变化，如细胞同时化、细胞生长受克制甚至细胞死亡。通过实验室的合理设计及建立规范的操作规程，能够减少环境中物理因素对细胞的影响。孵箱应放在温度较恒定的环境中，周边不能放置能引发机械振动的设备，如离心机。培养液及培养试剂应放在固定的位置，为避免光照试剂不能放在玻璃门的冰箱中，试剂周边不能放同位素。培养液从冰箱中取出后应在室温中放置一段时间后再进行实验，以避免过冷的温度对细胞的影响。2.2化学性污染的来源、危害及防止培养环境中许多化学物质都能够引发细胞的污染［2］。化学物质并不总是克制细胞的生长，某些化学物质如激素就可增进细胞的生长。不同细胞对化学物质污染的反映是不同的。未纯化的物质、试剂、水、血清、生长辅助因子及储存试剂的容器都可能成为化学性污染的来源。细胞培养的必需养分，如氨基酸，若浓度超出了适宜的范畴，也会对细胞产生毒性。同样，不同细胞系其最佳培养条件下对血清和缓冲液的规定是不同的，在培养中应严格控制。玻璃制品清洗过程中残留的变性剂或肥皂(普通残留在瓶盖的内表面)是最常见的化学性污染。2.2.1水水是唯一一种在凝固时膨胀的化合物。因此在选择冻存细胞的容器时应考虑到这个因素。容器因水的膨胀而发生破裂是引发试剂污染的重要因素。为了避免金属离子、有机分子、细胞内毒素等物质对水的污染，在配制液体，清洗容器时必须使用不含杂质的超纯水［4］。需要注意的是，超纯水放置过久其纯度会下降。在高压蒸气灭菌及蒸馏水时水经常被污染，由于高压蒸气锅及纯水机的常规维护后可能有少量的化学物质残留。为了确保水的纯度，我们应采用方法尽量避免化学物质的残留。2.2.2血清动物血清是细胞培养中惯用的天然培养基，但血清又是潜在的生物及化学污染的来源。由于血清采集于多个动物，并且不同厂商的生产工艺及质量各不相似，因此血清中许多成分的浓度存在很大的变异。血清对不同细胞的促生长能力及毒副作用取决于这些细胞的分化功效、组织来源及培养基的成分等因素。在进行一系列实验时，为了确保明验的可重复性，最佳选用同一批次的血清。2.2.3培养液、培养附加成分、试剂培养液、培养附加成分、试剂都可能成为化学性污染的来源。细胞培养使用的全部物质都应是高纯度的，并通过权威机构的鉴定，实验者本人也应对上述成分进行纯度鉴定。同时，对的配备和储存培养液及试剂也是非常重要的，应当采用原则的操作环节，避免液体体积计算错误，混用类似化合物等错误。2.2.4培养器皿及容器细胞培养过程中会使用到多个不同的培养器皿及容器。培养器皿的大小，构形设计可能会影响到培养中气体交换、湿度、培养液的pH值和细胞生长密度。培养器皿的工艺及灭菌过程中的差别可能对培养体系产生影响。塑料制品在生产过程中可能残留某些有毒成形剂，生产工艺的不同可能引发器皿表面附着能力的不同。储存不同物质时应选用适宜的塑料或玻璃容器，由于酒精、强酸、强碱能够溶解塑料或玻璃的某些成分。2.3生物性污染的来源、危害及防止外界的微生物如昆虫、节肢动物、原虫、霉菌、病毒、细菌、无细胞壁的微生物（普通指支原体）和其它类型的细胞都可能侵入培养环境引发污染［2，3］。只要在一种开放的环境中进行培养，都难以避免发生污染。发生污染的可能性取决于操作办法、培养室的无菌环境以及实验室的规章制度。生物性污染对细胞代谢的影响，可因污染源和细胞的种类不同而体现各异。细菌、真菌或其它微生物污染的检测能够用不同培养基进行检查［5］。支原体污染的检测需要特殊的办法。病毒污染的检测能够使用许多体内或体外实验，涉及大鼠或小鼠的接种、逆转录酶分析、凝血实验、红细胞吸附实验等。细菌和真菌的污染较易发现并及时去除，而大多数实验室对支原体的污染缺少足够的认识。为了避免支原体及其它微生物污染的发生和传输，必须建立规范的无菌操作程序及多个规章制度。支原体归属于柔膜体纲（Mollicutes）的支原体目，它们都含有下列共性：无细胞壁、无细胞壁重要成分——粘肽的体现。支原体与其它细菌不同之处还在于其胞膜中含有胆固醇或其它甾醇，这种特性使支原体膜更具柔顺性，对于物理因素，如压力、渗入压、脱水的抵抗力很大［3］。支原体直径仅有0.3～0.8μm，并且变形能力大，故能通过滤菌器。需要指出的是，只要有一种含有增殖能力的支原体就能引发培养体系的污染。一旦细胞被污染，支原体的滴度随着时间的延长而逐步升高，最高可至每毫升109克隆。最为致命的是，即使存在很严重的支原体污染，细胞外观可无明显变化。如果继续使用这种已被支原体污染，而貌似正常的细胞做实验，将会严重影响实验成果。2.3.1来源培养体系中支原体污染的最可能途径是经已被支原体污染的细胞扩散和传输。细胞被支原体污染后，支原体能够与宿主细胞形成一种共生体系，使污染不停扩大。一旦发生支原体污染，支原体和其它微生物会随着飞沫而不停传输。操作过程中移液，倾倒液体时都会产生含有潜在感染能力的飞沫，并沉积在接触到的表面。这种污染性飞沫能存活数天甚至数星期。另外，操作失误引发的交叉污染也是支原体污染的一种常见途径。人体的组织及体液成分是细胞培养中支原体污染的重要来源。污染的细胞中普通能分离到人类口腔支原体、发酵支原体、唾液支原体以及其它某些与人有关的支原体，如M.buccale，M.faucium，M.homonis，M.pirum和生殖支原体等。无菌操作过程中，操作者能产生有污染性的随空气传输的飞沫和微粒，造成培养体系的污染。人体外周血、骨髓、淋巴组织原代培养中有可能发生发酵支原体的原发污染（primarycontamination），这也证明支原体在分化细胞中较未分化细胞更易生长。随着培养技术的不停发展，人们已能培养来自不同物种如动物、植物、昆虫的多个细胞，同时也扩大了支原体及其它微生物的宿主范畴。另外，某些支原体，如菜氏无胆甾原体科（Acholeplasmalaidlawii）、M.arginini、M.hyorhinis、口腔支原体、唾液支原体能寄生不同的宿主，并能在培养体系中稳定增殖数年。牛血清中能分离到A.laidlawii、M.arginini和M.hyorhinis支原体，因此血清可能成为支原体污染的来源。由于无血清培养基中许多附加成分及试剂是从血清或其它生物制品中制备的，因此无血清培养体系并不能排除支原体污染的危险。尽管随着培养技术的进步，血清发生污染的可能性进一步减少，但只要有一种活的支原体能通过滤菌器，整个培养体系就会被污染。2.3.2危害支原体通过产生代谢产物及消耗多个养分，如核酸前体及必需氨基酸，从而变化细胞的代谢状态。支原体能够酵解糖，分解精氨酸，氧化丙酮酸，解脲支原体能够运用尿素作为能源，这会使细胞代谢发生一系列变化，从而影响蛋白质、DAN、RNA合成以及嘌呤从头合成及赔偿合成途径。污染时间的长短及核酸代谢变化决定了支原体污染造成的危害程度，造成细胞染色体断裂、重排、非整倍体的出现。随即，细胞的生长特性发生变化，使某些酶和细胞因子的产生增加，并体现出某些特殊的细胞功效，而其它某些细胞正常的功效则被克制。某些支原体附着在细胞表面后，会与宿主细胞交换膜抗原成分。随着细胞膜成分的变化，细胞的形态及抗原性发生变化。细胞污染对研究工作带来的最大危害是由于错误的实验成果造成研究误入歧途。另外，支原体污染还会干扰细胞的筛选，如杂交瘤细胞生长受到克制并丧失产生单抗的能力（附表）。附表支原体污染对细胞的影响分类可能的危害1杂交瘤技术1融合细胞无分泌单抗的能力2杂交瘤细胞产生的单抗不是针对靶抗原，而是针对支原体3支原体消耗胸腺嘧啶，干扰HAT*筛选4在HAT筛选过程中丧失了杂交瘤细胞2细胞遗传学1造成羊水污染2姊妹染色单体交换增多3染色体随机断裂和畸变增多4产生额外的染色体5干扰羊水培养的成果6精子污染后受精能力下降7染色体数目减少3病毒学1转录酶活性下降2干扰某些逆转录病毒的分离3减少禽痘病毒的感染力及空斑的形态4诱导人单核细胞产生干扰素5克制腺病毒的增殖6诱导小鼠脾细胞产生干扰素7污染病毒疫苗8引发巨细胞病毒及带状病毒形成假空斑9减少腺病毒及SV40胸腺嘧啶的掺入10克制腺病毒和单纯疱疹病毒的增殖11克制脊髓灰质炎病毒和牛痘病毒的增殖12支原体与病毒在蔗糖梯度离心中共沉淀13克制新城病病毒（NDV）产生干扰素14丧失HIV敏感细胞4代谢1减少鸟氨酸脱羧酶的产生2减少蛋白质和RNA的产生3消耗培养液中的精氨酸4变化尿苷／尿氨酸的比例5减少DNA和RNA的合成6增加胸腺嘧啶的降解7诱导3T3细胞产生胶原酶8增加致癌物诱导芳香烃羟化酶的产生9增进淋巴瘤细胞的增殖10减少嘌呤替代途径11减少ATP水平12减少脱氢酶的水平13减少氧的消耗14克制胸腺嘧啶的掺入5生物反映性1引发鼠的淋巴细胞发生转化2增进肿瘤坏死细胞因子的释放3克制同种抗原引发的细胞毒性反映4诱导NK细胞产生细胞毒性因子5增进支原体与宿主细胞交换抗原6产生类淋巴因子的活性7变化成淋巴样细胞产生的免疫球蛋白8诱导细胞产生抗支原体的多克隆抗体9克制某些淋巴细胞的分裂10对胸腺细胞产生毒性11活化鼠的巨噬细胞*HAT：次黄嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶核苷系统2.3.3防止及控制污染发生后首先应拟定污染物的种类及污染的程度。为了能对的检测细菌或支原体的污染，应先撤去培养液中的抗生素。常规细胞传代培养中应用抗生素会造成：①掩盖了不很严重的污染；②造成了耐药菌的产生。每一种抗生素的抗菌谱都是有限的，并且许多抗生素仅是克制细菌生长，而非杀菌剂。由于支原体无细胞壁，因此青霉素，头孢菌素等干扰细胞壁合成的抗生素对于支原体无效。菌检及支原体检测只有在撤去抗生素后才干进行。实验中若发生污染或其它问题应有具体的统计，并由经验丰富的专家分析，找出哪个环节出了问题，涉及培养液的配备、实验室环境的保持和无菌操作过程等，从而不停完善操作规程，避免类似问题的出现。另外，管理者还应制订细胞培养的各项规章制度，教育每一种实验人员恪守。实验室负责人应根据状况，制订修改各项规范的操作程序及人员培训计划。普通来说，随着实验室规模的扩大，细胞发生变异和污染的可能性增加了［5］。因此，大型实验室应严格制订各项操作程序及规章制度。细胞培养中无菌操作需要清洁的工作环境、实验的合理安排、实验者纯熟的操作技巧及强烈的责任感。只有通过不停地学习、训练，才干纯熟掌握无菌操作技术。为了尽量减少污染的发生，以常规检查的方式来监督是必要的。细胞培养中发生污染是不可避免的，我们的目的是尽量减少污染的发生及危害。根据美国实验室的调查报告显示，最少10％的细胞系存在支原体的污染［2］。一旦发生污染，如果细胞有具体的统计，则污染引发的危害较小。我们能够根据细胞定时菌检统计，拼弃最后一次细胞菌检阴性后的实验成果。运用菌检阴性的细胞重新开始实验。如果仅偶然进行菌检或采用非特异检测办法，特别是支原体污染，那么拟定污染的范畴比较困难。由于全部的细胞系都有可能被交叉污染。一旦发生污染，全部未进行菌检的冻存细胞都必须进行菌检，以去除污染的细胞并明确污染发生的时间。2.3.4检测由于支原体污染并不引发细胞外观的明显变化，故常规的支原体检测非常必要的。人们可运用一系列直接或间接的办法检测支原体。但由于支原体种类的多样性，现在还没有一种方便、广谱、特异性高、精确的检测办法。因此，有必要对不同检测办法的敏捷度及局限性有所理解。不同检测办法对送检标本的规定不同，如果标本不合格，将不可能获得对的的成果。血清、培养液或培养基附加成分在加工和储存过程中污染会在一定程度上被稀释，影响检出率［6］。间接检测法由于其敏感性较差，若不采用浓缩标本，则不合用于检测血清和培养液的污染。由于污染物的随机分布，因此仅进行一次检测普通会出现假阴性［1］。如果标本中污染物浓度低于10个污染物／ml，随机抽取1ml标本进行检测可能有36.6％的假阴性率。增加标本体积，浓缩标本有助于减少假阴性率。另一种假阴性的产生是由于污染物在试剂瓶，冻存瓶等容器中的分布不均所致。若20个样品中有一种被污染（5％的污染率），检测全部20个样品，假阴率为36.6％。需要指出的是，仅仅单次检测一种标原来判断有无生物性污染的作法是不可靠的。因此，在分装液体前，就应当从原液中尽量多取一点液体进行检测。如果不能做到这一点，则应当用原则办法选择多个标本进行检测。例如，在无菌过滤操作中，随着滤过体积的增大，滤膜破损的可能性增加，故应选择最后过滤的液体进行检测。标本的解决与标本的选择同样重要。多个酶如胰酶、脂酶，强酸，强碱或其它化学物质会破坏支原体膜的脂质，使支原体丧失活力及膜的完整性。膜的完整性被破坏后，支原体内的蛋白酶及核酶释放，从而会干扰间接检测办法的成果。如果标本收集后不能当天检测，则应当尽快冻存标本以避免降解。选择、解决检测标本的目的是尽量发现潜在的污染。在细胞培养过程中就应考虑到支原体污染的检测。我们最佳选用无抗生素培养，检测应尽量离传代时间长一点，方便让任何潜在的污染物生长、繁殖。为避免支原体活力丧失，如果检测的是贴壁细胞，应采用刮除细胞的办法，由于胰酶或其它生化分离办法会减少支原体的活性。在选用适宜的检测办法时，应考虑到支原体的滴度和活力这两个因素。直接培养法是最敏感的，但也是最耗时的检测办法，大概需28天。从理论上讲，只需一种有活力的支原体就能在培养基上生长。但某些难以培养的支原体限制了直接培养法的应用。抱负的直接培养法应采用多功效的培养基，以减少假阴性率［7］。为增加对低滴度和低活力支原体检出率，应采用有氧和无氧两种培养条件及几个传代方式。直接培养法还需要活性支原体作为阳性对照，并且耗时，操作繁琐，因而不适于大多数实验室。检测支原体污染的间接法涉及：PCR、ELISA、电子显微镜检查、DNA探针、DNA荧光染色及生化分析法等。间接法能检测到107／L的滴度。普通状况下，支原体污染后其滴度普通超出109／L，故尽管间接法不敏感，但相对较精确。由于支原体的多样性，体现不同特异性的抗原及酶，为生化及免疫检测法带来技术上的困难［8］。在选择PCR、DNA探针等办法前，应考虑好选择适宜的靶序列及引物序列。DNA荧光染色法和直接培养法相结合是支原体检测的金原则［5］。美国、加拿大、日本和欧共体国家生物制药及诊疗的监督机构推荐使用这种办法。其基本原理在于运用不同的技术，多次检测，以弥补多个检测技术的缺点，增加检测成果的可信度。2.3.5控制及排除控制支原体污染或其它生物性污染的唯一可靠的办法是全部可能污染的物品用高压蒸气灭菌法消毒。全部细胞培养设备都应消毒，应严格恪守上述的各项规章制度及监督制度，直至全部潜在的污染源都被消除。细胞一旦被支原体污染，要将它去除是非常困难的。由于某些不可复得的细胞被污染，人们不得不设法去除污染，挽救某些贵重的细胞。事实上，经支原体污染的细胞，在污染经解决被去除后，细胞原有的许多生物学特性，如基因的体现，抗原性和代谢特点也随之发生了对应的变化。排除支原体污染的办法，涉及使用抗生素、抗血清、裸鼠体内接种、巨噬细胞吞噬、胰酶消化等办法，但没有一种办法是普遍有效的。因此在采用每一种办法时必须对其效果，以及对细胞可能产生的毒性影响进行监测。DelGuidice和Gardella［6］提出了一种有效的办法，其基本环节涉及首先分离、鉴定污染物及测定对抗生素的敏感性，然后使用最少两种敏感的抗生素进行解决。为增加排除污染的有效性，能够通过稀释以减少血清及其它促生长因子的浓度，从而减少细胞的密度。治疗后细胞应在无抗生素条件下培养若干代，以拟定污染已被彻底去除。细胞培养过程中支原体污染不易察觉，细胞被支原体污染后去除非常困难，支原体污染的细胞在支原体被去除后，其细胞特性会发生很大变化，对研究成果造成严重影响。因此，为了确保细胞培养体系免受污染的影响，核心是加强防止方法。作者介绍：李颖健(南京大学医学院博士硕士)参考文献1JohnsonRW.Qualityassuranceoftissueculturemed