微生物的生长曲线

三、单细胞微生物的典型生长曲线将少量纯种单细胞微生物接种到恒容积的液体培养基中后，在适宜的温度、通气（厌氧菌除外）等条件下，它们的群体会有规律地生长起来。每隔一定时间取样，测菌细胞数目。以细胞数目的对数值作纵坐标，以培养时间作横坐标，可以画出一条有规律的曲线即单细胞微生物的典型生长曲线。生长曲线代表了单细胞微生物在新的环境中从开始生长、分裂直至死亡的整个动态变化过程。单细胞微生物的典型生长曲线

延滞期指数期稳定期衰亡期又称：停滞期、调整期、适应期－“万事开头难”1、特点：生长速率常数R=0;细胞形态变大或增长;细胞内RNA特别是rRNA含量增高，原生质嗜碱性增强;合成代谢活跃（核糖体、酶类、ATP合成加快），易产生诱导酶;对外界不良条件反应敏感（如氯化钠浓度、温度、抗生素等理、化学药物）。（一）延滞期2、在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期，措施有：①接种龄：对数生长期的菌种接种,子代停滞期短；稳定期的菌种接种，子代停滞期居中；停滞期或衰亡期菌种接种，子代停滞期长。②增加接种量；一般来说，接种量增大可缩短甚至消除延迟期（发酵工业上一般采用1/10的接种量）。③调整培养基的成分，应适当丰富，且发酵培养基成分尽量与种子培养基的成分接近。（二）指数期1、特点：生长速率常数R最大，即代时最短;细胞进行平衡生长，菌体大小、形态、生理特征等比较一致;酶系活跃，代谢最旺盛。x2x1t2t1t2-t13.322(lgx2-lgx1)生长速率常数R=t2-t13.322(lgx2-lgx1)代时G=

繁殖代数n=3.322(lgx2-lgx1)2、指数期中的的三个重要参数一些细菌的代时菌名 培养基 培养温度 代时E.coli（大肠杆菌） 肉汤 37℃ 17minE.coli

牛奶 37 12.5 Enterobacteraerogenes（产气肠细菌） 肉汤或牛奶37 16~18 E.aerogenes

组合 37 29~44B. Cereus（蜡状芽孢杆菌） 肉汤 30 18B.thermophilus（嗜热芽孢杆菌） 肉汤 55 18.3Lactobacillusacidophilus（嗜酸乳杆菌） 牛奶 37 66~87Streptococcuslactis（乳酸链球菌） 牛奶 37 26S.lactis

乳糖肉汤 37 48Azotobacterchroococcum（褐球固氮菌） 葡萄糖 25 344~46 Mycobacteriumtuberculosis（结核分枝杆菌）组合 37 792~93 Nitrobacteragilis（活跃硝化杆菌） 组合 27 1200（1）菌种：不同菌种其代时差别极大。（2）营养成分：同一种微生物，在营养丰富的培养基上生长时，其代时较短，反之则长。（3）营养物浓度：既影响微生物的生长速率，又影响它的生长总量。（浓度0.1～2.0mg/mL影响生长速率，浓度2.0～8.0mg/mL时影响最终产量）（图）（4）培养温度：温度对微生物的生长速率明显的影响。3、影响指数期微生物代时长短的因素营养物浓度与对数期生长速率和产量8.0mg/ml6.0mg/ml4.0mg/ml2.0mg/ml1.0mg/ml0.5mg/ml0.2mg/ml0.1mg/ml只最大收获量受影响生长速度和最大收获量受影响时间细胞数或菌体量4、应用指数期的微生物具有整个群体的生理特性一致、细胞各成分平衡增长和生长速率恒定等优点。（1）用作代谢、生理等研究的良好材料；（2）是增殖噬菌体的最适宿主；（3）是发酵工业中用种子的最佳材料。（4）进行染色、形态观察等的良好材料。（三）稳定期1、特点：（1）R=0，即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等，或正生长与负生长相等的动态平衡之中。（2）菌体产量达到了最高点。（3）菌体产量与营养物质的消耗间呈现出有规律的比例关系。（4）细胞内开始积聚糖原、异染颗粒和脂肪等内含物；芽孢杆菌一般在这时开始形成芽孢；（5）通过复杂的次生代谢途径合成各种次生代谢物。

Y指生长产量常数/生长得率，表示微生物对基质利用效率的高低，即消耗每g或mol营养物质所产生的菌体干重（g）。Y=x–x0C0

–C=x–x0C02、生长得率3、稳定期到来的原因（1）营养物尤其是生长是限制因子耗尽；（2）营养物的比例失调；（3）酸、醇、毒素或H2O2等有害代谢产物的累积；（4）pH、氧化还原势等物理化学条件越来越不适宜等等。4、应用（1）对以生产菌体或菌体生长相平行的代谢产物的最佳收获期；（2）是对维生素、碱基、氨基酸等物质进行生物测定的最佳测定时期；（3）通过对稳定期到来原因的研究，促进了连续培养原理的提出和工艺、技术的创建。（四）衰亡期1、特点：（1）细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数，群体中的活菌数目急剧下降，出现“负生长”（

R＜0）；（2）细胞出现多形态，畸形或衰退形；（3）因菌体本身产生的水解酶及代谢产物的作用，使菌体死亡、自溶等。（4）有的微生物进一步合成或释放次生代谢物。（5）芽孢杆菌在此期释放芽孢等。生长特点成因菌体特征应用及其它调整期对数期稳定期衰亡期不立即繁殖繁殖速度最快出生率等于死亡率,活菌数最大,代谢产物大量积累死亡超过繁殖适应新环境条件适宜生存条件开始恶化生存条件极度恶化代谢活跃,体积增长较快个体形态和生理特性稳定有些种类出现芽孢出现畸变与菌种和培养条件有关生产用菌种科研材料改善和控制条件,延长稳定期细胞裂解释放产物单细胞微生物生长的四个时期四、微生物的连续培养分批培养：将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入。不再补充和更换，最后一次性收获。连续培养：在微生物培养的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时排除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时间地处于对数生长期，以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。1、概念

单批培养恒浊法恒化法单批培养 连续培养 时间连续流入新鲜培养液lg细胞数（个/ml）连续培养恒浊器（turbidostat）这是根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速，以取得菌体密度高、生长速度恒定的微生物细胞的连续培养器。在恒浊器中的微生物，始终能以最高生长速率进行生长，并可在允许范围内控制不同的菌体密度。恒化器（chemostat或bactosen）与恒浊器相反，恒化器是一种设法使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖的一种连续培养装置。这是一种通过控制某一种营养物的浓度，使其始终成为生长限制因子的条件下达到的。2、连续培养方法

特点：基质过量，微生物始终以最高速率进行生长，并可在允许范围内控制不同的菌体密度；但工艺复杂，烦琐。使用范围：用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。（1）恒浊器—恒浊连续培养（2）恒化器—恒化连续培养特点：维持营养成分的亚适量，控制微生物生长速率。菌体生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，产量低于最高菌体产量。应用范围：实验室科学研究。装置控制对象培养基培养基流速生长速率产物应用范围恒浊器菌体密度（内控制）无限制生长因子不恒定最高大量菌体或与菌体形成相平行的产物生产为主恒化器培养基流速（外控制）有限制生长因子恒定低于最高不同生长速率的菌体实验室为主恒浊器与恒化器的比较2、连续发酵将连续培养用于发酵，即为连续发酵，相对于单批发酵而言。SCP的生产、乙醇、乳酸、丙酮和丁醇的发酵、石油脱蜡、污水处理等应用。优点：高效，简化了操作装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等单元操作；自控：便于利用各种仪表进行自动控制；产品质量稳定；节约大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、电的负荷均衡合理。缺点：菌种易于退化；易于遭到杂菌污染；营养物利用率低于单批培养。连续发酵的生产时间受以上因素限制，一般只能维持数月~1年。五、微生物的个体生长和群体的同步生长

使用同步培养技术，即设法使群体中的所有细胞尽可能都处于同样细胞生长和分裂周期中，然后分析此群体的各种生物化学特征，从而了解单个细胞所发生的变化。通过同步培养而使细胞群体处于分裂步调一致的状态即同步生长。进行同步分裂的细胞称为同步细胞。

获得同步生长的方法获得同步生长的方法主要有两类：（1）环境条件诱导法：抗生素、变换温度、光线、培养基等，造成与正常细胞周期不同的周期变化。（2）机械筛选法：选择性过滤、梯度离心或膜洗脱法。物理方法，随机选择，不影响细胞代谢。硝酸纤维素膜法细菌细胞会粘附于具有相反电荷的硝酸纤维微孔滤膜上。第二节、影响微生物生长的主要因素几个基本概念1、灭菌：是指采用强烈的理化因素，使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施称为灭菌。分杀菌和溶菌2、消毒：指采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒的物体基本无害的措施。3、防腐：是指采用某种物理,化学或生物因素,抑制物体上的微生物进行生长繁殖,从而达到防止食品等发生霉腐的措施.处理方法有:低温、缺氧、干燥、高渗、高酸、高醇、加防腐剂等。第二节、影响微生物生长的主要因素一、温度（一）1.微生物生长要有一定的温度范围温度升高，细胞生化反应速率加快，每升高10℃加快1倍，但温度升高，细胞内pr、酶和核酸可能受到不可逆的破坏按微生物的生长速度划分→M温度三基点;最低生长温度：指微生物能进行生长繁殖的最低温度界限。微生物在此范围内尚能生长，但生长很慢，若低于此温度，则生长受到抑制，甚至死亡。一般-10—-5℃，极端-30℃最高生长温度：指微生物能进行生长繁殖的最高温度界限。微生物处于这个温度，尚能生长，但生长慢，若高于此温度，则易于衰老和死亡。一般80-95℃，极端105-150℃最适生长温度：指微生物生长速率最高时的温度。最适生长温度不等于积累代谢物最高时的培养温度。例：乳酸链球菌的生长最适温度为34℃，发酵产酸最快的温度为30℃

2、微生物按其生长温度范围分三大类群

低温型微生物:-10-30℃，最适宜10-20℃，分布在地球两极的水域和土壤，海洋或冷藏场所中。

嗜温型微生物:10-45℃，最适宜25-40℃，大多数微生物。

高温型微生物:25-80℃，最适宜50℃1.干热灭菌（1）烘箱热空气法条件：150-170℃，维持1-2h。

效果：可杀死细菌的芽孢，如梭状芽孢杆菌。应用范围：用于玻璃器皿、金属用具等的灭菌。(2)灼烧灭菌利用火焰直接把微生物烧死应用范围：适合于对接种针、环、试管口及不能用的污染物品或实验动物尸体等的灭菌。2、湿热灭菌1、常压法

(1)巴氏消毒法条件:60-85℃,维持15S-30min(传统法:60-65℃,30min)

效果：可杀死大多数细菌、真菌，孢子及酵母仍存活。应用范围：短期保存食品。(2)煮沸消毒法条件：100℃，加热10-30min。

效果：可杀死全部细菌、真菌，不能杀死孢子应用范围：饮用水、注射器、毛巾及解剖用具的消毒；水果罐头、果酱等食品。

(3)间歇灭菌法条件：80-100℃,加热15-60min,冷却后37℃保温,重复三次。效果：可杀死全部细菌及芽孢。应用范围：不耐热培养基灭菌。

2、加压法(1)加压蒸汽灭菌法条件：121℃（压力1kg/cm2），5-20min，

或115℃，35min。

效果：可杀死全部细菌,大多数孢子应用范围:实验室、医院、发酵工厂器材、物料及肉类、蔬菜、奶制品灭菌(2)连续加压蒸汽灭菌法条件：135-140℃,5-15s

效果：可基本达到无菌

应用范围：发酵工厂培养基及液态食品奶、果汁、蔬菜汁灭菌。影响加压蒸汽灭菌效果的因素影响蒸汽灭菌效果的因素：A、

物体含菌量B、

排冷气程度C、

PH值D、体积E、

加热和散热程度如灭菌对象是砂土、石蜡油等体积大、含菌多、传热差的物品，则应适当延长时间。在加压蒸汽灭菌中，要引起注意的一个问题是，在恒压之前，一定要排尽灭菌锅中的冷空气。

高温对培养基的有害影响及其防止1、有害影响(1)形成沉淀物：多肽类、磷酸盐、碳酸盐等。

(2)破坏营养,提高色泽:产生氨基糖、焦糖或黑色素——褐变

（3）降低PH值

(4)降低浓度：气温低时增加冷凝水2、防止措施（1）采用特殊加热灭菌法：分别灭菌后再混合；低压或间歇灭菌；瞬时灭菌。（2）过滤除菌:使用滤膜或过滤器，如烧结玻璃板、石棉板,硅藻土过滤器等,缺点是无法去除病毒和噬菌体。

（3）其它方法：易发生沉淀的，按配方逐一加入成分；加0.01%EDTA（乙二胺四乙酸）0.01%NTA（氮川三乙酸）等螯合剂防止金属离子沉淀；用氧化乙烯对个别成分灭菌。1、降低酶活性。大多数微生物活动降低、休眠，甚至死亡。少数能生长。①细胞内水分转变为冰晶体,引起细胞明显脱水,而不能存活。②细胞内形成的冰晶对微生物细胞产生机械性的伤害。注意：①微生物不同，反应不同②冷冻速度不同，反应不同③冷冻和解冻交替，比一直冷冻更易死亡。④环境条件不同，反应不同：pH低、水分多，死亡快；糖、盐、蛋白质、脂肪含量高则死亡慢。（二）低温对微生物的影响

（三）低温用于食品保藏低温保藏是食品贮藏中，品质下降最低的一种贮藏方法。１、寒冷温度：（14-7℃）嗜冷微生物能生长，但生长比较慢，贮藏有效期比较短，贮藏果蔬食品。２、冷藏温度：（7-0℃）（常用4-8℃）嗜冷微生物能缓慢生长，多数病原菌不能生长，保藏有效期较短，贮藏食品：肉、禽蛋、乳品、果蔬等。３、冻藏温度：低于0℃（常用-18℃）几乎可以阻止所有微生物的生长，可进行长期贮藏，但由于影响食品品质，所以食品工业中一般采取：冷藏

二、pH（一）微生物生长的pH值范围1、总体说，M生长2＜pH＜9,少数例外.绝大多数在5-92、每种M,有自己的生长pH三基点:最低、最适和最高pH值。大肠杆菌:最低pH4.3,最适pH6.0-8.0,最高pH9.5。3、碱M:喜欢偏碱环境，多数细菌、放线菌细菌：最适pH7.0-7.6放线菌:7.5-8.54、嗜酸M：适合偏酸环境，多数真菌和酵母菌.

霉菌：最适pH4.0-5.8酵母菌：3.8-6.05、耐碱M：pH＞9可生活,如脱氮硫杆菌pH11下可生活6、耐酸M：pH＜4可生活，如氧化硫硫杆菌pH1下可生活（二）作用机理1、pH值能影响细胞膜的电荷，从而影响营养物质的吸收；2、pH值能影响代谢过程中酶的活性，从而影响M生命活动（三）生产中的应用

1、发酵食品：酸奶、酸菜等2、酸渍食品：如加入醋酸，增加食品风味。3、消毒防腐：如醋酸,可杀死沙门氏菌,大肠杆菌等。条件：对人体无毒害，不影响食品的风味，加入食品后的含量应不超过规定的标准。举例：①苯甲酸及其钠盐：pH2.5-4.5抑菌作用强，果汁、酸性饮料，含量应≤0.1％②山梨酸及其钾盐：pH＜6对霉菌、酵母抑制强,用于酸性食品防腐饮料。③丙酸以及其钙盐：酸性环境，抑制霉菌，含量≤0.32％。用于酸类、糖类、干酪。④脱氧醋酸及其钠盐：毒性低，广谱抑菌。用于浓缩桔浆、清凉饮料⑤乳酸：抑制细菌，用于空气消毒。培养基pH变化的原因及调节

原因:1.大多数微生物使培养基pH下降.如乳酸菌分解G产生乳酸2、有些微生物使培养基pH上升.如尿素细菌水解尿素产生氨pH调节治标治本过酸时：过碱时：加NaOH、Na2CO3等碱液中和过碱时：加H2SO4、HCl等酸液中和过酸时过碱时加适当氮源：加尿素、NaNO3、NH4OH或蛋白质提高通气量加适当碳源：加糖、乳酸、醋酸、柠檬酸或油脂等降低通气量三、氧化还原电位定义：氧化还原反应中，电子从一种物质转移到了另一种物质，在两者之间产生了电位差，叫氧化还原电位单位：（mV)因为微生物的生长需要能量，所以微生物的生长与环境中的Eh相关自然环境中的Eh：816---421mV816mV,氧化反应需氧-421mV,还原反应厌氧1、影响Eh的因素O2存在Eh较高pH高而Eh较低还原性物质低Eh2、微生物生长需要的Eh好氧+Eh300-400mV兼性厌氧100-350mV微需氧50mV厌氧-Eh-150mV四、光和射线

除了光合微生物外，大多数微生物不需要光，但有些微生物虽然不是光合微生物，可是它们表现一定的趋光性。例如灵芝菌在散射光光照下，才能长成具有长柄的盾状或耳状子实体。太阳光除可见光线外，还有长光波的红外线和短光波的紫外线以及更短的电磁波包括X—射线和r—射线。它们都具有杀菌的作用，波长越短，杀菌作用越强。（一）紫外线紫外线的波长范围在136nm—390nm，不同波长的紫外线，具有不同的杀菌力，250nm—280nm波长的杀菌力最强。作用原理：主要是细胞中的核酸（DNA）具有吸收紫外线的能力，使核酸中的碱基配对发生错误，从而影响了DNA的复制，轻则发生突变，重则造成死亡。象人们一般把东西拿到太阳光下曝晒，用的就是阳光中具有紫外线，具备杀菌作用的原理。目前，紫外线以用做强杀菌剂，有的已制成了紫外线杀菌灯管，放在无菌室中进行杀菌而用。另外，紫外线在遗传育种领域中用来做为诱变剂，因紫外线能引起DNA中碱基排列次序发生变化，从而引起了基因突变，产生新种。（二）X—射线和r—射线

X—射线和γ—射线具有更短波长，也具有强的杀菌作用，作用的原理引起物质电离，如水的电离，使水形成H和OH的自由基；自由离子与溶液中经常存在的氧分子产生一些具有氧化性的过氧化物如H2O2（过氧化氢）等，而使细胞受到损伤甚至死亡。低剂量的X—射线和r—射线可作为诱变剂，而使遗传育种中，高剂量作为杀菌剂。六、化学药物很多化学药物对微生物有杀菌作用和抑制生长作用。低剂量的化学药物对微生物起抑制或防腐作用，高剂量的化学药物对微生物起杀菌作用。

化学药物杀菌剂种类很多，现分如下几大类进行讨论。（一）重金属盐类有无机和有机的重金属盐类，如汞、银、铅、锌、铜等重金属元素的化合物都有很强的毒性杀菌作用很强。杀菌原理：主要使细胞中蛋白质凝固变性或与酶以及某些活性物质的活性基团结合，妨碍这些基团的正常作用，而起抑制细胞生长的作用。（二）氧化剂

过氧化氢（H2O2）、高锰酸钾（KMnO4）次氯化钙[Ca（OCl）Cl或Ca（OCl）2]以及卤素如游离的氯、溴、碘、氟和它们的化合物等，都是氧化剂。

杀菌原理：是破坏原生质结构或氧化细胞结构中的一些活性基团而发生杀菌作用。（三）还原剂硫酸亚铁（FeSO4）、甲醛（HCHO）都是常用的还原消毒剂，甲醛是气体，但能溶解于水中，因而市场售的一般都是30—40%的水溶液甲醛。

杀菌原理：主要能与蛋白质的酰基或巯基起反应，引起蛋白质变性，而死亡。（四）表面活性物质

乙醇、甲酚、来苏尔、石碳酸（酚）、新洁尔灭、肥皂等都是表面活性洁净消毒剂。

杀菌原理：①降底细胞的表面张力；②能使蛋白质变性和损伤胞壁以及质膜的作用；③是破坏细胞膜的渗透性。（五）无机碱类和酸类

氢氧化钾（KOH）、硫酸（H2SO4）、氢氧化钠（NaOH）物质，都能起杀菌作用。

杀菌原理：引起细胞物质的水解和凝结，例如，1%HCl、1%NaOH起杀菌作用。（六）毒性物质二氧化硫（SO2）、硫化氢（H2S）、一氧化碳（CO）和氰化物（HCN）。

杀菌原理：对原生质中的一些活性基团或辅酶成分能发生专性结合，使其失活，降低代谢活动或使代谢不能进行，达到杀菌作用。（七）染料

结晶紫、碱性复红、孔雀绿等染料都有一定杀菌作用。杀菌原理：主要是染料中有发色团和助色团，能和原生质中的电荷结合，使蛋白质变性，而达到杀菌作用，低浓度可起到抑制微生物生长的作用。各种环境的因素对于微生物的生长发育的影响，有一定的规律性，在各种因素的最低和最高限度之间，微生物才能进行生命的活动，在最适的程度时，微生物的活动能力最强。例如对于一种微生物不合适的PH值，可以因为温度提高而加强它的不利影响，环境中温度过高，不适宜于一种微生物生长时，可以增加一些合适的营养物质而使继续生长等。但是在许多因素综合的一定环境中，某一因素的改变往往可以发生主导的影响。

第三节抗生素对微生物的作用就一般而言，抗生素是通过抑菌和杀菌来达到效果的：1.干扰细菌细胞壁合成2.抑制细菌蛋白质合成3.抑制细菌核酸合成4.损伤细菌细胞膜5.增强吞噬细胞的功能抑菌杀菌1、抑制细胞壁的形成事实上，β-内酰胺类抗生素又可分为以下几类：青霉素类头孢菌素类碳青霉烯类头霉素类单环β-内酰胺类β-内酰胺类抗生素的作用机理抗生素与细菌细胞壁构成分子的构象相似，竞争性阻断交联合成进而阻碍细菌细胞壁的合成，导致细菌在低渗透压环境下膨胀破裂死亡