金银花花色色素及药用有效成分分析

金银花花色色素及药用有效成分分析

作为观赏植物的主要特征之一，色彩不仅是衡量观赏价值的重要指标，也是植物种类差异的重要依据（张超等，2012）。研究表明:影响花色的色素主要有叶绿素(chlororphyll)、类胡萝卜素(carotenoids)、类黄酮(flavonoids)与生物碱(alkaloid)(赵昶灵等,2003;Tanakaetal.,1998)。金银花(Lonicerajaponica)为忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬属藤本植物,1年内能够多次开花,花期很长,由最开始的绿色过渡到白色,最后变成黄色,而且其所含的绿原酸与木犀草苷等物质具有很高的药用价值(Shangetal.,2011),因而它集药用、观赏与绿化于一体,有很高的经济价值(方建新等,2006)。目前对金银花的研究主要集中在药用价值方面,其体内绿原酸、木犀草苷等多酚类物质含量的测定已经做过很多的研究(郑敏等,2009;孟晓岩等,2012;Seoetal.,2012)。本试验通过薄层层析、紫外可见分光光度法、高效液相色谱法对金银花花瓣不同花发育期相关花色色素及药用有效成分进行定性与定量分析,探讨其花色的变色原因及花色与药用有效成分间的关联性,为金银花新品种培育及根据颜色判断药材品质提供理论支持。1材料和方法1.1农业科技有限责任公司苗圃基地试验材料为金银花栽培品种‘金花三号’,采自陕西省杨凌金山农业科技有限责任公司苗圃基地。选取生长健壮、长势一致的植株,依次采集初蕾期、绿蕾期、小白期、大白期、银花期、金花期的花(图1),在-20℃低温保存,备用。1.2冷冻干燥机、旋转蒸发仪、超声清洗器日立L-2000高效液相色谱仪,岛津-2450紫外可见分光光度计,三用紫外分析仪(上海嘉鹏科技有限公司),真空冷冻干燥机,旋转蒸发仪,超声清洗器。甲醇、乙腈为色谱级购自Spectrum公司,标准品槲皮素、木犀草素购自天津金测分析技术有限公司,芦丁、绿原酸购自天津一方科技有限公司,山奈酚购自Sigma公司,乙醇、正丁醇、冰醋酸、石油醚、乙酸乙酯均为国产分析纯。1.3标准曲线的绘制和测定取保存在-20℃冰箱中的金银花,放置于-80℃冰箱中预冻24h后,用真空冷冻干燥机处理72h后研磨成粉末备用。甲醇萃取液(类黄酮分析用)的制备:分别称取金银花6个花发育期冷冻干燥后的粉末0.3g,用10mL甲醇萃取,超声提取3次,合并萃取液,旋转蒸发后用甲醇定容至10mL(Lietal.,2007),试验重复3次。乙醇萃取液(叶绿体色素分析用)的制备:参考高俊凤(2000)的方法,分别称取金银花6个花发育期冷冻干燥后的粉末0.05g,用5mL95%乙醇超声波萃取30min,放入4℃冰箱中保存备用,试验重复3次。水解萃取液(木犀草苷分析用)的制备:取400μL甲醇萃取液加入1.5mL离心管中,添加600μL2mol·L-1的盐酸,在95℃条件下加热45min。冷却后加入300μL异戊醇萃取,并剧烈晃动,然后放入4℃冰箱中待其分层,上层液体含有木犀草苷水解后的木犀草素,收集上相液体置入新管中保存于4℃冰箱中待用(Lietal.,2007)。取甲醇萃取液和乙醇萃取液用玻璃毛细管分别点样于已经活化过的纤维素薄层板上,然后各自放置到装有流动相BAW和PAE(表1)的层析缸中展开,测定各展开系统中显色斑点在薄层板上的Rf值(宋学英等,2002;Lietal.,2007)。对于肉眼很难看清的黄酮物质,在紫外光(254nm)下和氨水烟熏薄层板后观察颜色变化。用岛津-2450紫外可见分光光度计在663,645和470nm测定乙醇萃取液(叶绿体色素分析用)在各个吸收波长处的吸收值,并据此计算叶绿素和类胡萝卜素的含量(高俊凤,2000),计算公式如下:分别取浓度为2mg·mL-1的芦丁标样0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL放到10mL的离心管中,加入0.2mL5%的NaNO2摇匀后静置6min;加入0.2mL10%Al(NO3)3,摇匀后静置6min;加入1mL4%NaOH,摇匀后室温静置15min;加入60%乙醇溶液定容至10mL,摇匀后在510nm波长下测定吸光度值,根据刘飞等(2005)的方法绘制标准曲线。然后吸取0.1mL金银花甲醇萃取液(类黄酮分析用)代替标准品进行测定,重复3次。金银花中总黄酮含量(mg·g-1)=10×C×V1/(M×0.1)。式中:C为测定样品液中总黄酮浓度(mg·mL-1);M为样品干质量(g);V1为样品最后定容体积(mL);0.1为测定时加入提取液量(mL);10为测定时提取液定容体积(mL)(李娟等,2007)。用日立L-2000高效液相色谱仪检测金银花甲醇萃取液(类黄酮分析用)和不同浓度的单体酚标样。检测参数:C18柱(250mm×4.6mm,5μm),柱温40℃,进样量为10μL,流速0.5mL·min-1。流动相参数:A为0.04%的甲酸水溶液,B为色谱级乙腈。采用梯度洗脱,洗脱程序为:0~40min,A95%~0,B5%~100%;40~60min,A0,B100%。检测波长为280nm。根据标样浓度与标样出峰面积绘制标准曲线,进而计算各单体酚含量(Lietal.,2007)。用日立L-2000高效液相色谱仪检测水解萃取液(木犀草苷分析用)中木犀草素的含量,检测方法与单体酚相同。金银花不同花发育期体内木犀草苷的含量计算公式如下:式中:m1为木犀草苷的含量;m2为水解后木犀草素的含量;m3为水解前的木犀草素的含量;M1为木犀草苷的相对分子质量;M2木犀草素的相对分子质量。参照唐前瑞(2001)的方法,分别称取2g金银花不同花发育期的花,加入1mL的双蒸水研磨成匀浆,然后用320-S的pH计测定匀浆的pH值,并以此来代表金银花细胞原液的酸碱度,试验重复3次。2结果与分析2.1类胡萝卜素的初步判定将金银花6个花发育期的乙醇萃取液在薄层板上点样后,放到流动相PAE中展开。如图2所示,金银花6个花发育期在薄层层析板上的绿色斑点逐渐变淡,到金花期呈现出黄色,计算Rf值为0.90,这与类胡萝卜素在流动相PAE中的Rf值基本一致(宋学英等,2002),基本可以判定为类胡萝卜素,其含量从初蕾期到银花期都呈下降趋势,但到了金花期含量急剧增加。将金银花不同花发育期的甲醇萃取液在薄层板上点样后,放到流动相BAW中展开4.5h,然后用氨水烟熏处理(图3A)后,斑点变得清晰,再放到紫外光下观察(图3B)。并计算各个斑点的Rf值,得到图中下排斑点的Rf值为0.44,与木犀草素-7-葡萄糖苷在BAW流动相中的Rf值相同;上排斑点的Rf值为0.78,与木犀草素在BAW流动相中的Rf值相同。再根据黄酮物质经过氨水烟熏后在紫外光下的颜色特征(Lietal.,2007),可以初步判定下排的物质为木犀草素-7-葡萄糖苷,上排为木犀草素。木犀草素的含量呈降低趋势,木犀草苷含量呈先上升后下降的趋势。2.2芦丁的标准曲线如图4所示,金银花花内的叶绿素的含量呈降低的趋势,从含量最高的初蕾期到最低的金花期,叶绿素的含量下降了近96.77%,并且叶绿素含量的下降速率也不相同,初蕾期到小白期下降较快,小白期到金花期逐渐趋于平缓(图4A);而类胡萝卜素的含量变化则为从初蕾期到银花期的小幅下降,到金花期的急剧上升,高出银花期10倍以上(图4B);且到金花期,类胡萝卜素与叶绿素的含量比值达到了10.3(图4C)。依据1.3.4中的方法制作芦丁的标准曲线,得到芦丁标准浓度Y(mg·mL-1)与吸光度X之间线性回归方程Y=0.5324X-0.007,R2=0.9998,根据回归方程计算金银花的花在不同发育期总黄酮含量(图5)。结果显示,金银花的花中总黄酮含量在初蕾期最高,为107.992mg·g-1,随着发育时间的推移其含量逐渐降低,在金花期含量最低,为58.893mg·g-1。2.3花发育期与绿原酸含量的关系金银花甲醇萃取液的高效液相色谱检测结果显示,绿原酸的含量随着花的发育而不断降低(表2)。在整个发育过程中,绿原酸含量降低的程度不同,即花发育前期(初蕾期、绿蕾期、小白期)下降的幅度较小,到了花发育后期(大白期、银花期、金花期)则呈现急剧下降的趋势,绿原酸含量在初蕾期为金花期的40倍;金银花中,呈现黄色的黄酮或黄酮醇等单体酚物质木犀草素、芦丁、槲皮素的含量都随着花的发育而降低,而山奈酚的含量基本保持不变。2.4不同花育种细胞原液的ph值金银花6个花发育期细胞原液的pH值处在5.30~5.50(图7),表明金银花在不同花发育期内其酸碱度基本保持不变。3不同植物细胞不同期花色素成分的变化在金银花的不同花发育期,检测到叶绿素、类胡萝卜素、木犀草苷、绿原酸及其他单体酚类物质。叶绿素、绿原酸与总黄酮的含量变化趋势均为:初蕾期>绿蕾期>小白期>大白期>银花期>金花期;木犀草苷的含量变化趋势为:绿蕾期>初蕾期>小白期>大白期>银花期>金花期;而类胡萝卜素的含量变化趋势初期为:初蕾期>绿蕾期>小白期>大白期>银花期,但到了金花期其含量则急剧增加。自然界中使植物呈现绿色的色素主要是叶绿素(赵昶灵等,2005),而使植物花呈现黄色的主要色素包括类胡萝卜素、甜菜黄素、类黄酮中的黄酮、黄酮醇、查尔酮、橙酮及其衍生物等(Forkmannetal.,2001),花色呈现红色、紫色的主要色素为花青苷色素(Shinzoetal.,2004)。金银花在初蕾期和绿蕾期叶绿素含量达到1.355mg·g-1左右,且其与类胡萝素的相对含量较高(图4),这导致其在初蕾期与绿蕾期呈现绿色;在小白期、大白期、银花期,随着花的发育,金银花中叶绿素、类胡萝卜素、木犀草苷的含量均逐渐降低,这导致了其颜色从最初的绿色逐渐变为浅绿色、白色。同时可以看到,金银花在大白期、银花期并非纯白色,而是稍带黄色(图1),这应该是因为其中存在少量类胡萝卜素、木犀草素和木犀草苷所导致的;从银花期到金花期,花由白色变为黄色,在这个过程中,木犀草苷、山奈酚、槲皮素等黄酮和黄酮醇物质含量在整个花发育期呈下降趋势,所以黄酮类物质有可能对金花期的黄色形成起到辅助作用,但不是金银花从银花期的白色到金花期的黄色变化的主要原因。在金花期,类胡萝卜素含量比银花期增加了10倍,而叶绿素的含量降低到最低,且类胡萝卜素与叶绿素的比值达到最高(图4)。因此,类胡萝卜素的生物合成急剧增加应该是其颜色从白色变为黄色的主要原因。白新祥等(2006)对菊花(Chrysanthemummorifolium)不同品种花色素成分的分析结果表明,其主要呈色色素为类胡萝卜素,与本试验金银花呈黄色为同一种色素。肉眼能够感知的黄色花色素主要有类黄酮和类胡萝卜素两大色素类群,有的植物只含类黄酮或类胡萝卜素其中一类;有的则是类黄酮和类胡萝卜素两者并存(周琳等,2009;Daviesetal.,2006)。本研究结果表明:金银花在金花期时类胡萝卜素的含量(0.444mg·g-1)比银花期含量(0.042mg·g-1)高10倍以上。而金银花从银花期过渡到金花期只有2~3天的时间,其花内类胡萝卜素的含量在短期内急剧提高,从这个角度来看,金银花可以作为类胡萝卜素次生代谢及相关生物合成基因转录表达研究的优良试验材料。植物细胞体内的pH值也是影响花色的重要因素之一。类黄酮中花色苷的稳定性就受到pH值变化的很大影响,它会随着pH值的升高而降低(Stracketal.,1989),而黄酮和黄酮醇则是随着酸性的减弱,黄色就会变得越强,从而影响花色;但是类胡萝卜素的颜色却不受pH值大小的影响(赵昶灵等,2005)。本试验结果显示,金银花在不同花期内,其pH值保持不变(图7),也说明了其花色变化与pH值变化无关。金银花在不同花发育期的化学成分检测结果显示,绿原酸在初蕾期(38.726mg·g-1)、绿蕾期(31.765mg·g-1)、小白期(28.018mg·g-1)的含量都达到了《中国药典》(≥15mg·g-1)的要求,但其在大白期、银花期和金花期含量均低于《中国药典》的标准。木犀草苷的含量在初蕾期(1.408mg·g-1)、绿蕾期(1.679mg·g-1)、小白期(1.116mg·g-1)、大白期(0.829mg·g-1)的含量均达到《中国药典》(2010年)(≥0.5mg·g-1)标准,但在大白期其含量略低于《中国药典》(2005年)(≥1.0mg·g-1)的标准;在银花期和金花期,木犀草苷含量均低于两部药典的标准。因此,为获得合格的药材,应采摘大白期以前的金银花花苞。同理,也可以根据金银花的颜色来判断其品质的好坏:也就是浅绿色(小白期及以前)的药材要优于淡黄色和黄色(大白期及以后)的药材。另外,现在市场上有些不法商贩用硫磺熏蒸金银花,使其呈现鲜艳亮丽的黄色,以提高售价,但金银花被硫磺熏蒸后会影响其药用成分的活性(马晓青等,2012)。本试验结果显示,就金银花中总黄酮、绿原酸、木犀草苷等活性成分而言,黄色比浅绿色的含量都要低;因此不管是硫磺熏蒸后呈现黄色还是本身就是黄色,其质量均不如呈现浅绿色的药材。所以,本试验结果有望为打击不法商贩、杜绝金银花硫磺熏蒸现象的发生提供有效帮助。随着花的发育,金银花中绿原酸的含量呈迅速下降趋势(表2)。如果在金银花的初蕾期、绿蕾期和小白期采收,虽然绿原酸的含量比较高,但其生药产量偏低;而在大白期(及以后)采收,绿原酸的含量又不达标,这样金银花的质量和产量就很难同时达到要求。Peng等(2010)发现,金银