hiv原发感染期实验室检测技术的研究进展

hiv原发感染期实验室检测技术的研究进展

人类免疫缺陷（hiv）的初始感染期是指从病毒进入人体，在抗体形成后的3.12个月。根据其临床表现和身体免疫反应的出现，可分为急性感染期和后新感染期。原发感染期HIV入侵、大量复制并播散于全身,而机体则产生各种抗HIV免疫应答,其间病毒和机体的相互作用机制研究对于明确获得性免疫缺陷综合征(acquiredimmunodeficiencysyndrome,AIDS)的发病机制、确立抗病毒治疗策略及预防HIV传播均有十分重要的意义,一直是HIV/AIDS研究领域的重点之一。但由于HIV原发感染期临床症状的非特异性和抗体检测窗口期的存在,对HIV原发感染的诊断较为困难。大规模队列研究表明,感染者病毒载量与HIV传播的风险密切相关,病毒载量越高,传播HIV的可能性越大。HIV/AIDS的整个病程中,经性途径传播HIV的风险呈“U”型,原发感染期和疾病终末期高于慢性感染期,其中抗体阳转后2.5个月内每次性行为感染其性伴侣的可能性平均为0.82%,显著高于慢性感染期的0.07%。因此,原发感染期在HIV传播中至关重要,特异、敏感、能有效缩短窗口期的实验室检测手段对于HIV/AIDS的防控极为重要,本文对HIV原发感染的4种实验室检测技术进行概述。1hiv-rna、苏-igm抗体阳性的诊断HIV经黏膜进入人体后2d内到达局部引流淋巴结,5d左右外周血中可以检测到HIVRNA,此后病毒快速复制,血浆病毒载量迅速达到峰值,随后在机体免疫应答作用下病毒载量降低并处于相对平稳的水平,即病毒调定点(set-point)。有学者根据病毒标志物在外周血中出现的时序将原发感染分为6期:Ⅰ期,仅可检测到HIVRNA;Ⅱ期,可检测到HIVRNA和p24抗原,抗体阴性;Ⅲ期,HIVRNA、p24抗原及抗HIVIgM抗体阳性,但免疫印迹实验仍无HIV特异性条带出现;Ⅳ期,同Ⅲ期,但免疫印迹结果为HIV抗体不确定,即所出现的条带尚未达到判读为阳性的标准;Ⅴ期,在Ⅳ期基础上,免疫印迹实验结果阳性,但缺乏p31(pol编码)条带;Ⅵ期,包括p31条带在内的免疫印迹实验全阳性。其中,Ⅰ～Ⅳ期持续时间较短,各期平均3～5d,累计持续约19～23d,Ⅴ期持续约70d,如果引入S/LS抗体检测,可进一步将Ⅵ期划分为新近感染期和慢性感染早期。学者对原发感染的检测技术进行了大量研究,关注的焦点有两方面:一是如何缩短窗口期,在抗体阳转之前确认感染者;另一方面是对于经HIV抗体检测为阳性的感染者如何区分其为新近感染者还是既往感染者。目前应用较广的检测手段主要包括:p24抗原检测、核酸扩增技术(nucleicacidamplificationtesting,NAAT)、敏感/次敏感抗体检测技术(sensitive/less-sensitiveenzymeimmunoassaytesting,S/LS抗体检测)、BED-捕获酶联法(BED-captureenzymeimmunoassay,BED-CEIA)等。其中前两种主要用于确认抗体阳转之前的感染者,后两种用于确认抗体阳性者是否为新近感染者。2第三代hiv抗体/抗原检测试剂从HIV进入人体到抗体产生通常需要大约3～4周时间,但p24抗原血症早于抗体阳转约5d出现,因此,检测p24抗原可缩短窗口期,是较早用于确定原发感染的实验室手段。美国从1995年起对献血人群常规筛查p24抗原,据统计这一措施的实施使得感染人群的检出率增加了25%。事实上,目前广泛应用的第四代HIV抗体/抗原检测试剂就是将HIV抗原与抗p24抗体一起包被固相载体,可同时检测样品中的抗体和p24抗原,这一技术的应用使得HIV感染的常规检测窗口期明显缩短。而第一代HIV抗体试剂以病毒裂解物为抗原包被固相,通过标记的抗人免疫球蛋白抗体检测样品中的抗体,平均窗口期为45d。第二代试剂原理同第一代,但固相用重组表达的HIV抗原包被,提高了特异性。第三代试剂使用合成多肽抗原或重组抗原,应用双抗原夹心法检测HIV抗体,除IgG抗体外还可检测IgM抗体,窗口期被缩短至22d,而且敏感性和特异性均优于标记抗人免疫球蛋白抗体的间接法。研究显示,第四代HIV抗体/抗原检测试剂在第三代试剂基础上又可进一步将窗口期缩短2～18d。将上述四代HIV抗体检测试剂在64份HIV原发感染者血样上进行验证,结果显示第一及第二代试剂检测结果阳性率仅为12.5%,第三代试剂检出率为42.2%,第四代试剂检出率增加至89.1%。3混合样本库检测HIVRNA是感染后外周血中最早出现的病毒标志物,因此NAAT检测病毒核酸在HIV原发感染的研究中发挥了重要作用。HIV抗体筛查的普遍应用大大降低了输血传播HIV的可能性,其残余风险主要来自抗体阳转前的原发感染者。为最大限度切断HIV的传播途径,美国从1999年起将NAAT用于献血者筛查。虽然核酸检测的敏感性优于p24抗原检测,但其费用也更高。因此在大样本的献血者筛查中,为提高效率,降低费用和劳动强度,研究人员设计了混合样本库(serumsamplepooling)的实验方案,将每十余份或数十到一百份左右的血清样品混合,先检测混合库样本的HIVRNA,对其中的阳性库样本再行混合形成更小的库,直至检测出单个的阳性标本。该方法费用低、敏感性好,并能达到性价比最佳的效果,可以用于大样本筛查,不仅可以应用于HIV,这一策略也应用于对梅毒、乙型及丙型肝炎病毒等的研究。有研究显示,美国实施献血员HIVRNA筛查的前3年,在37164054例次HIV抗体阴性献血员中发现了12例处于窗口期的急性HIV感染者。美国一项观察性研究以北卡莱罗纳州州立HIV咨询检测点的HIV高危人群为对象,对其先进行标准抗体筛查,抗体阴性者再经混合样本库方案进行核酸检测,分析比较标准HIV抗体检测与抗体、核酸联合检测的效果。为期1年的研究共纳入109250例对象,有606例被确认为HIV感染,其中583例抗体阳性,23例抗体阴性而核酸阳性确认为急性感染者,抗体联合核酸检测使HIV感染病例的检出率增加了4%。针对男同性恋人群的研究显示HIVRNA检测可使HIV感染的检出率增加6%～9%。泰国一项研究对曼谷一家HIV自愿咨询检测门诊2006年3月至2007年9月收集的样本进行了NAAT筛查,从5402例经由第四代抗体检测结果为阴性的样本中发现了7例NAAT阳性感染者,据此计算出相应高危人群的HIV新发感染率为2.7/100人年(95%CI:2.2/100人年～4.3/100人年),而且新发感染者主要集中在男男性行为人群,为制定合理的HIV流行干预措施提供了信息。以上研究表明核酸检测能够显著提高HIV感染的检出率,对HIV流行的监测和控制具有重要意义。4hiv抗体检测结果对于HIV抗体阳性的感染者确认其为新近感染者还是既往感染者,对于HIV流行疫情的准确判断、防控措施效果的评价具有重要意义。近年建立了数种判断新近感染期的方法。HIV进入人体后,机体所产生HIV抗体的滴度随着感染时间延长逐渐增高。根据这一原理,对样本进行两次抗体检测,一次检测对较低的抗体滴度敏感,另一次对较低的抗体滴度不敏感。如果敏感HIV抗体检测为阳性的样本用次敏感检测转为阴性,则提示为新近感染期。如果两次检测结果均阳性表明其为既往感染。研究表明,此种敏感-阳性/次敏感-阴性的抗体检测结果可一直持续到感染后170d。上述美国北卡莱罗纳州的研究对HIV抗体筛查为阳性的样本进一步进行了次敏感抗体检测,以获得新发感染率数据,结果显示583例抗体阳性样本中有107例处于新近感染期,综合S/LSEIA及NAAT结果得出该人群的HIV新发感染率为2.2/1000人年。以往关于HIV原发感染的研究数据多是基于B亚型的,近期一项研究采用NAAT和S/LSEIA方法筛选了70例C亚型HIV原发感染者,研究其病毒学及免疫学指标的动力学变化,有助于明确HIV感染的机制。5hiv抗体阳性患者筛查情况BED-CEIA是指针对HIV的定量酶联免疫法,用羊抗人IgG抗体包被固相,捕获血浆或血清中的HIV特异性IgG抗体和其他IgG抗体,通过HIV抗体和非HIV抗体的相对数量可获知样品中HIV特异性lgG抗体占总IgG抗体的比例。感染者体内总IgG抗体中特异性HIV抗体所占比例在抗体阳转后2年持续增高,根据总抗体中特异性HIV抗体的比例可估算大致感染时间,该方法可区分约155d左右的新近和既往感染。我国国家艾滋病参比实验室于2005年将BED-CEIA方法引入我国。美国亚特兰大进行的一项研究采用标准抗体筛查、NAAT、S/LSEIA及BED-CEIA对2202例HIV咨询检测点的样本进行检测,共发现70例HIV感染者,其中标准抗体筛查测出66例,NAAT发现抗体阴性而核酸阳性的急性感染者4例,抗体阳性者中经S/LSEIA或BED-CEIA确认为新近感染者分别为11和12例,分析显示S/LSEIA和BED-CEIA两者具有较好一致性。有研究者对旧金山2004年前往性病门诊寻求HIV咨询检测者的样本进行筛查,抗体阴性者采用NAAT检测HIVRNA,抗体阳性者经BED-CEIA确认其感染时间,从3789份样本中检测出136例HIV感染者,其中有11例为抗体阴性而HIVRNA阳性的急性感染者,NAAT使检出率增加了8%,而125例抗体阳性者中有44例被确认为新近感染者并据此计算出该人群年HIV新发感染率为2.5%(95%CI:1.8%～3.3%)。有研究对S/LSEIA和BED-CEIA两种方法进行了比较。美国旧金山进行的一项横断面研究以前往性病和HIV检测咨询门诊就诊的男男性行为者为对象,比较S/LSEIA和BED-CEIA的一致性,从15010份样本中检测出658份HIV抗体阳性样本,S/LSEIA和BED-CEIA两种方法分别检出155和148份新近感染期样本,一致性检验(Kappa检验)的Kappa值为0.77(95%CI:0.72～0.82),提示两者具有较好的一致性。一项在多米尼加进行的研究以482名女性商业性性服务者为对象,在其中16例HIV抗体阳性者中经S/LSEIA和BED-CEIA两种方法分别确认了3例和2例新近感染者,计算出相应HIV新发感染率分别为1.4%(95%CI:0.2%～5.3%)和1.0%(95%CI:0.1%～4.4%),两种方法间Kappa值达到0.8(95%CI:0.3～1.