中空纤维膜液相微萃取-高效液相色谱法测定醋酸氯己定趾栓中醋酸氯己定的含量

中空纤维膜液相微萃取-高效液相色谱法测定醋酸氯己定趾栓中醋酸氯己定的含量

作为一种消毒消毒剂，醋酸氯仿对革兰氏阴性和革兰氏阳性菌的抗菌和杀菌能力较强。近年来，它的用途日益扩大。醋酸氯己定痔疮栓主药成分为醋酸氯己定,辅料为半合成的脂肪酸酯。临床用于内痔、外痔等肛肠疾病及手术前后的消毒和预防感染。醋酸氯己定的含量为该栓剂的主要质量控制指标。现有的醋酸氯己定含量测定方法主要有紫外分光光度法、导数分光光度法和高效液相色谱法(HPLC)。采用上述方法时,样品需要先用环己烷或乙醚萃取,然后用醋酸溶液再反萃取,步骤多,操作麻烦,容易造成样品损失,而且使用乙醚和环己烷会对环境造成污染。近年来,液相微萃取作为一种新的样品预处理方法用于环境复杂样品的分析。该方法的主要优点在于:1.所需有机溶剂用量少(一般为1~40μL),可大大提高萃取时的传质速度,从而缩短萃取时间。2.萃取后,样品萃取液可直接取出,无需静置分离,简化了样品处理的步骤。3.易于实现样品的纯化和富集,并且降低了干扰,提高了分析灵敏度。但该方法有以下缺点:1.将萃取液直接加到样品溶液中,在萃取过程中不能剧烈搅拌,萃取靠样品扩散进行,因而萃取速度较慢。2.萃取溶液易于挥发,因此萃取时间不能长,萃取往往达不到平衡,导致灵敏度提高不多。另外,萃取在非平衡状态下进行,使得萃取过程难于控制,重复性不佳。Ma等和张朝辉等采用液-液-液三相微萃取,解决了微萃取溶剂与毛细管电泳和HPLC流动相兼容问题,但是该方法增加了萃取步骤,操作复杂,同样是将萃取剂直接加到中间相溶液中,萃取也是在非平衡状态下进行,因而灵敏度增加也不多。Pedersen-Bjergaard等采用中空纤维膜液相微萃取的新方法,首先将萃取液装在中空纤维膜中,然后将装有萃取液的中空纤维膜置于样品溶液中进行萃取。该方法允许剧烈搅拌,从而提高了传质速度;还可以有效地防止萃取剂的挥发;确保液相微萃取在平衡条件下进行,因此该法既具有液相微萃取的优点,又克服了它的缺点。本文采用中空纤维膜液相微萃取技术处理样品,应用高效液相色谱测定醋酸氯己定痔疮栓中醋酸氯己定的含量,测定结果与药品所示含量一致,与未经液相微萃取的高效液相色谱方法相比灵敏度提高了约24倍。1氧指数和标准化学势法液相微萃取原理(装置如图1)与液液萃取原理相同,组分在水相和有机相之间的平衡是热力学平衡,当萃取达到平衡时,组分在水相和有机相中的化学势相等,即有μw=μo,因μw=μθw+RTln(cwcθ),μo=μθo+RTln(cocθ)μw=μwθ+RΤln(cwcθ),μo=μoθ+RΤln(cocθ),故ln(cocw)=(μθw−μθo)/(RT)ln(cocw)=(μwθ-μoθ)/(RΤ)。在一定的温度、压力下,μθw,μθo为常数,故cocw=Pcocw=Ρ亦为常数。上述公式中,μw,μθw,μo,μθo分别为待测物在水相和有机相的化学势及标准化学势;P为分配系数;co为有机相中组分的浓度;cw为水相中组分的浓度。当萃取达到平衡时,co就是水相中药物浓度(cw)的P倍。在液相微萃取中,因为有机相与水相的体积比很小,萃取过程中水相中组分的浓度变化不大,从而使组分得到分离与富集。2实验部分2.1材料、仪器和膜高效液相色谱仪包括Constametric4100泵,Waters486检测器,ChromPerfect数据采集和处理系统。S21-2恒温磁力搅拌器(上海司乐仪器有限公司)。聚丙烯中空纤维膜(内径1mm,壁厚70μm,膜孔径0.45μm,膜孔率70%,天津大学化工学院膜研究所)。醋酸氯己定标准品(中国药品生物制品检定所),醋酸氯己定痔疮栓(黑龙江天龙药业有限公司),正辛醇(分析纯,天津市博迪化工有限公司),乙腈(色谱纯,康科德试剂有限公司)。磷酸、三乙胺、醋酸、醋酸钠(均为分析纯)。试验用水为二次蒸馏水。2.2流动相色谱柱为WatersSymmetryC18柱(150mm×3.9mmi.d.,5μm);流动相为乙腈-水(体积比为29∶71,含三乙胺0.3%,pH3(磷酸调节)),流速为1mL/min;进样量为10μL;检测波长为260nm。2.3标准溶液的制备精密称取醋酸氯己定标准品50mg,溶于100mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,得到质量浓度为0.5g/L的标准溶液。2.4醋酸提取方法取1粒样品,精密称定,温热使其融化,混匀后冷却,加1.5mol/L的醋酸溶液提取5次(分别用20,20,15,15,10mL醋酸溶液),合并提取液,置于100mL容量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀。2.5纤维复合膜的制备将中空纤维膜截成长约8cm的小段,用甲醇洗3次以除去中空纤维膜表面的杂质,干燥除去残余甲醇。在中空纤维膜小段中加入30μL的正辛醇。用大约70℃的镊子用力夹中空纤维膜小段的两端将两端封死。在一个8mL的瓶中加入适量的醋酸/醋酸钠缓冲溶液、适量的样品溶液和水,使最后体积为7mL。在25℃和常压下,将装有正辛醇的中空纤维膜小段置于该溶液中,启动电磁搅拌器,搅拌速度保持为600r/min,萃取20min后将装有正辛醇的中空纤维膜小段取出,剪开小段的一端,从中取10μL萃取液用于高效液相色谱进行分析。3结果与讨论3.1ph值对醋酸氯己定峰面积的影响考察了缓冲液pH值为3.6~8.0时对萃取效果的影响,缓冲液组成为0.2mol/L醋酸/醋酸钠缓冲液和0.2mol/L磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液。从图2可以看出,缓冲液pH值为3.6~4.6时,醋酸氯己定的峰面积随pH的增加而增加得很快;pH值为4.6~5.0时,其峰面积随pH的增加而增加,但增加幅度比较小;pH值大于5.0时,峰面积随pH的增加而降低;峰面积在pH为5.0时最大。出现这种现象的原因在于:pH小于5.0时,醋酸氯己定分子中的氨基与氢离子结合,主要以铵盐的形式存在,醋酸氯己定在水溶液中的溶解度增大,在正辛醇相中的浓度降低;pH大于5.0时,醋酸氯己定分子中的醋酸主要以醋酸根的形式存在,醋酸氯己定在水溶液中的溶解度增大,在正辛醇相中的浓度降低;pH=5.0时,醋酸氯己定主要是以分子的形式存在,在水溶液中的溶解度小,在正辛醇相中的浓度最大。本实验选取的缓冲液为0.2mol/L醋酸/醋酸钠缓冲液(pH5.0)。3.2萃取时间对组分粒径的影响待测组分在两相中达到分配平衡需要一定的时间,本文考察了液相微萃取达到平衡的时间。在电磁搅拌速度为600r/min下,在15min之前,待测组分在正辛醇相中的浓度随萃取时间的增加而增加;在15min之后,待测组分在两相中达到平衡(见图3)。为了确保每一次测定都是在萃取平衡的条件下进行,本实验选取的萃取时间为20min。3.3醋酸氯己定标准品溶液的制备在6.76mL醋酸/醋酸钠缓冲液(pH5.0)中加入224μL质量浓度为16mg/L的标准溶液。精密取10μL进样,记录醋酸氯己定的色谱峰(见图4-a)。在该溶液中放入装有30μL正辛醇的中空纤维膜,萃取20min后,精密取10μL进样,记录醋酸氯己定的色谱峰(图4-b)。图4-b中醋酸氯己定的峰面积为3345271,图3-a中醋酸氯己定的峰面积为135678,前者的峰面积为后者峰面积的24.6倍。3.4纤维复合膜的制备精密量取7,10,14,28,56,112,168,224μL对照品溶液,加入适量的pH5.0的0.2mol/L醋酸/醋酸钠缓冲液,使体积达到7mL,制备成质量浓度为0.50,0.71,1.0,2.0,4.0,8.0,12.0,16.0mg/L的标准溶液。在中空纤维膜中加入30μL的正辛醇,萃取20min后,取10μL萃取液进样分析。以峰面积Y为纵坐标,以水相中药物的质量浓度X(mg/L)为横坐标,得回归方程为Y=210791X-27626.1(r2=0.9998),表明醋酸氯己定在0.50~16.0mg/L范围内与其峰面积具有良好线性关系。3.5中空纤维膜的制备分别取224μL样品溶液,依次加入6个装有6.76mL醋酸缓冲液(0.2mol/L,pH5.0)的小瓶中,分别放入装有30μL正辛醇的中空纤维膜。萃取20min后,分别取萃取液10μL进样,记录醋酸氯己定的峰面积,6次测定峰面积的相对标准偏差为1.0%。3.6醋酸氯己定标准品溶液分别取224μL已知含量的样品溶液,置于装有6.76mL醋酸缓冲液(0.2mol/L,pH5)的小瓶中,依次加入14,28,42μL醋酸氯己定标准品溶液。按本文实验方法测定醋酸氯己定的含量,计算回收率,结果见