生姜细菌性青枯病防治药剂的筛选

生姜细菌性青枯病防治药剂的筛选

植物细菌的绿色斑点是由茄子引起的。这是各种植物（如茄子）的毁灭性疾病。由于没有理想的防治方法,往往得不到有效的控制,从而造成严重损失。特别是生姜青枯病(姜瘟病),一般减产20%～30%,重者达50%以上,遇到高温多雨年份,可以造成大面积的绝产。应用拮抗性细菌防治青枯病是比较理想的方法。最近几年,我们从生姜块茎周围的土壤中筛选到一株产生芽孢的细菌B1301,该菌株对茄伯克氏菌、小麦纹枯病菌(Rhizoctoniacerealis)、全蚀病菌(Gaeumannomycesgraminisvar.tritici)、棉花立枯病菌(Rhizoctoniasolani)、枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum)和黄萎病菌(Verticilliumdahliae)在平板上有强烈的拮抗作用;该菌还产生大量的细胞分裂素,刺激植物根系发育;田间试验结果表明,B1301对花生、生姜、番茄和马铃薯青枯病有显著的防治效果,例如对姜瘟病的防治效果一般在80%左右,增加作物产量,用于生姜处理时增产率为20%左右(未发表)。本研究对B1301进行了种类鉴定,探讨、评价了对生姜青枯病的作用机理与防治效果,现将结果报告如下。1材料和方法1.1类型识别1.1.1培养特性牛肉汁蛋白胨琼脂培养基(NA)和金氏B(KB)培养基上28℃培养2d后观察。1.1.2等重要鉴别特征观察细菌的形态,包括细菌菌体形状、芽孢形态以及鞭毛等重要鉴别特征。一般特征采用苯酚品红染色法,芽孢采用孔雀石绿染色法,鞭毛采用西萨-基尔(Ceseres-Gill)染色法,其余特征观察均按参考文献进行。1.1.3生理生化测定项目卵磷脂酶、明胶的液化、不同温度下的生长试验、接触酶试验、V.P.试验(产生3-羟基丁酮试验)及pH变化、产生吲哚试验、淀粉水解试验、苯丙氨酸脱氨酶试验、从糖类(D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖和D-甘露醇)产酸和产气试验、好气性测定等生理生化测定项目按照参考文献、进行。1.1.4肪酸甲酯气相色谱鉴定采用BIOLOG公司MicroStationSystem进行,按说明书操作。脂肪酸甲酯气相色谱鉴定(Gas-ChromotographyofFattyAcidMethylEsters,GC-FAME)采用微生物鉴定系统版本4进行(MIS,MIDIInc.Newark,Delaware)。按照文献进行操作。1.2第二、制备nd-pcr病原菌在NA培养基平板上测定了B1301的抗生作用,指示菌株为生姜青枯病菌ZO-1(本实验室分离自山东省莱芜市)。包括5种处理,(1)活菌体:将病原菌混入培养基,点接B1301;(2)死菌体:先将B1301在NA培养基上培养48h,用氯仿熏蒸24h杀死,喷布1×108cfu/ml的病原菌悬浮液;(3)水洗死菌体:在牛肉汁蛋白胨培养液(NB)中培养B1301,离心水洗3次,用氯仿熏蒸24h全部杀死,取50mg湿菌体点接于混入病原菌的NA平板上;(4)原上清液:将B1301的72h培养液过滤除菌后,取50μl置于混入病原菌平板中央的穴内;(5)热处理上清液:将除菌的培养液100℃处理10min,取50μl置于混入病原菌平板中央的穴内。所有处理设5次重复,在28℃下培养3d,测量抑菌带宽度。1.3位置竞争1.3.1活菌数调查抗性标记的B1301(抗利福平1200μg/ml)在NB培养液中培养48h,离心后取菌体混入灭菌轻质碳酸钙干粉中,使活菌数达5.8×109cfu/g,稀释100倍,浸健康种姜30min,植于花盆中。立即取样50～60g姜块,加同量灭菌水洗涤姜表面,然后于含300μg/ml利福平的NA平板上稀释回收,检查菌数,以后每隔一定时间回收一次。测定老姜和新姜块茎上B1301的群体,观察B1301能否从老姜块茎向新姜块茎转移。1.3.2青枯病菌群体培养测定B1301处理种姜对姜块茎表面(姜块茎表面外紧贴的1mm土层)、块茎际(姜块茎表面外松散附着的1～2mm土层)、块茎围(姜块茎表面外没有附着块茎的2～5mm土层)中青枯病菌群体的影响。用B1301悬浮液(1×108cfu/ml)处理种姜30min,然后栽于盆钵内。盆钵土壤事先用病姜组织液均匀接种。处理50d后,用含放线菌酮50μg/ml的TZC选择性培养基分别测定姜块茎表面、块茎际和块茎围的青枯病菌群体,以未经B1301处理的种姜为对照。1.4种姜的接种与培养选择生姜青枯病作为盆栽试验的防治对象。先将B1301于NB培养液中培养48h,使菌数达到5×108cfu/ml,离心取菌体,制成5×108cfu/ml的水悬液备用。花盆内装麦田土,以病姜组织液进行均匀接种,使土中青枯病菌达2×106cfu/g。市场购买的健姜块,掰成50～60g大小的种姜100块,分成5份,每份分别按姜块数量的0、5%、10%、15%和20%取出姜块,以病姜组织原液浸泡10min予以接种,然后混入种姜,再以B1301菌悬液处理30min后植于花盆内。每花盆植20株作为一个处理,重复5次。另取100块种姜,每盆20株作为一个处理,重复5次,同样接种后以清水处理植于花盆内作为对照。3个月后观察防治效果。2结果与分析2.1关于s1301的生长特性及与巨大芽孢杆菌的关系B1301在KB和NA培养基上生长良好,菌落灰白或污白色,不透明,有皱褶,老龄菌落可以成为粘稠的菌落。菌落圆形或不规则形,培养2d菌落直径为1～2cm,边缘不整齐,呈波状。菌体杆状,鞭毛周生,3～5条;革兰氏染色反应阳性,芽孢为近似柱形,孢子囊不膨大,没有伴孢晶体。B1301的以下特征呈阳性:接触酶和卵磷脂酶反应,从D-葡萄糖产酸,水解酪蛋白、明胶、淀粉和酪氨酸,利用柠檬酸盐和丙酸盐生长,在30℃环境下生长。B1301的以下特征呈阴性:厌氧生长,V.P.试验,从L-阿拉伯糖和D-木糖产酸,利用木糖生长,从苯丙氨酸脱氨,产生吲哚以及在5℃生长。BIOLOG鉴定结果表明,B1301与巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)的相似系数为0.669,而与Bacillusazotoformans的相似系数为0.001,与其它8种可能种类的相似系数均为0。GC-FAME给出的鉴定结果表明,B1301为巨大芽孢杆菌。根据《伯杰氏系统细菌学手册》中有关芽孢杆菌的描述,认为B1301与巨大芽孢杆菌最为接近,除了卵磷脂酶一项性状与其描述不同外,其余性状均相同。结合BIOLOG和GC-FAME结果,认为B1301为巨大芽孢杆菌。2.2抗生物质对浚粒干抗素的稳定性活菌体、死菌体都表现出明显的拮抗作用,抑菌带宽度平均分别为1.2cm和1.3cm,说明抗生物质对氯仿不敏感。原上清液和热处理的上清液抑菌带宽度也没有差别,均为0.8cm,说明抗生物质对热也不敏感。水洗死菌体也有微弱的抑菌作用,抑菌带宽度约为0.1cm,说明抗生物质主要存在于培养基中。2.3不同处理的生姜茎的培养测定结果表明,生姜块茎周围3个部位(种姜块茎表面、块茎际和块茎围)土壤中青枯病菌的群体分别为:97cfu/g土、1.3×104cfu/g土和9.0×104cfu/g土,表现出明显的梯度,即离生姜块茎越近,青枯病菌越少;对照分别为3.8×103cfu/g土、8.0×104cfu/g土和1.0×105cfu/g土,梯度不如处理明显,而且块茎表面部位的群体比处理高近40倍。说明B1301处理定殖于生姜块茎后,可有效地减少青枯病菌群体,离块茎表面越近,青枯病菌受到的抑制作用越强,是B1301能够保护生姜不受青枯病菌侵染的关键之一。2.4本不变、以升温结果见表1。B1301可在姜块表面定殖,处理后80d内菌数基本不变,前期甚至有所回升。B1301还可从老姜转移至新姜,但转移量不大,处理80d后,新姜表面的菌数约为老姜表面的10%左右。110d后,新姜块茎群体与老姜块茎相同,但是群体明显变小。2.5防治效果不下降结果见表2。可见无论用哪种比例接种,B1301都能够降低生姜青枯病的发病率。但是接种比例超过10%时,防治效果明显下降;接种比例达到20%时,防治效果只有10.5%。说明B1301对种姜自身携带病原菌的防治效果较差。在控制好种姜带病率的情况下,B1301可以很好地控制生姜青枯病的发生。3使用杆菌s1301植物青枯病的生物防治研究已经有许多报道,其中涉及到的拮抗微生物种类繁多。从1964年至今,曾经试验过的拮抗微生物有噬菌体、放线菌、无致病力产生细菌素青枯病菌、芽孢杆菌和荧光假单胞杆菌等。防治对象包括番茄、花生、烟草等的青枯病。我们曾经利用一株芽孢杆菌在田间防治生姜青枯病获得成功。本文分离到的芽孢杆菌B1301曾经用作菌肥,被认为可以分解有机磷。B1301具有卵磷脂酶活性,有可能从有机态磷中释放出磷素营养。植物青枯病生物防治的作用机理研究也有许多报道,主要包括细菌素、抗生素、竞争作用和诱导抗病性。本研究表明B1301的作用机制主要是抗生物质和竞争作用,两种机制的相互关系还需要进一步探讨。发现B1301在对种姜带菌(病)率比较高时防治效果明显下降,表明该菌株对已经侵染块茎的病原菌抑制作用比较差,可能菌体不能进入块茎内部形成内生状态或者是数量偏少。这种情况下,诱导植物产生抗病性