黑兰州皮提取物体外抑菌效果研究

黑兰州皮提取物体外抑菌效果研究

黑虎（lem.）a.c.smith，又名冷饭和南五味子，属于木兰科五味子科的多年生多年生乔木。分布于中国华南、华东、西南部等省。黑老虎为民间中草药,药用部位是根和藤茎,主要用于治疗跌打骨折、风湿骨痛、女性痛经、慢性胃炎、急性胃肠炎等症。黑老虎的垂直攀援性好,叶子四季碧绿,花形美丽,花香袭人,果形奇特,果肉香甜。黑老虎作为一种极具开发价值的集食用、观赏、绿化及药用于一体经济树种,越来越受到人们的关注,已有一些地区开始人工栽培。前期研究发现黑老虎的根及藤茎中含有生物碱、酚类、木脂素、萜类及挥发油等药用成分,具有抗肿瘤、抗氧化、抗-HIV、解毒等功效。黑老虎果实为聚合果,果肉营养价值较高,含有丰富的氨基酸和微量元素,但目前对其果皮的药效成分的研究却鲜有报道。本文对黑老虎果皮的抑菌活性进行了初步研究,并确定了抑菌成分的极性部位,为黑老虎果药用价值的进一步研究开发提供科学依据。1材料表面1.1果皮、果皮和种子成熟的新鲜黑老虎果于2008-10采自广西的桂西北地区,存放于-20℃冰箱备用。实验时将果实取出,于室温解冻后用镊子将果皮、果肉和种子分开,分别称重。果皮于45℃烘箱中干燥,取部分果皮剪成直径6.0mm的圆片用于抑菌实验,其余果皮粉碎用于有效成分的提取。1.2乙醇浸提液的制备将干燥的果皮粉碎,秤取10g果皮粉,用50ml70%(V/V)的乙醇在室温下浸提4h,过滤后的滤渣用等量的乙醇再提取1次。合并两次滤液,在40℃下减压浓缩至10ml,得到相当于含生药1g/ml的乙醇提取液用于随后的实验。1.3菌株和培养基本实验所用的大肠埃希氏菌Escherichiacoli、金黄色葡萄球菌StaphyloccocusaureusRosenbach、铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa、伤寒沙门氏菌Salmonellatyphi、枯草杆菌Bacillussubtilis和白色念珠菌Moniliaalbicans由广西中医学院微生物与免疫教研室提供。白色念珠菌(属真菌)用沙保氏液体养基(北京陆桥技术有限公司)于28℃培养72h,其余细菌用Mueller-Hinton(M-H)液体培养基(北京陆桥技术有限公司)于37℃培养24h。吸取菌悬液用血球计数板计数,用相应的液体培养基将菌悬液调整到含菌浓度约106个/ml,立即用于制备含菌平板或最小抑菌浓度的测定。2方法2.1培养材料的制备用无菌镊子夹取直径为6.0mm的经过湿热灭菌(121℃,20min)的滤纸圆片,分别放入乙醇提取液或各相萃取液中浸泡10min。另取浸泡蒸馏水的滤纸片为阴性对照,浸泡200μg/ml的头孢氨苄溶液的滤纸片为阳性对照。含药滤纸片于45℃中烘干,冷藏于4℃备用。分别取0.1ml不同菌悬液加到90mm的平板培养基上,用灭菌涂棒均匀地涂布在培养基表面,制成含菌平板。细菌用M-H琼脂培养基(北京陆桥技术有限公司),真菌用沙保氏琼脂培养基(北京陆桥技术有限公司)。取干燥的果皮圆片或含药滤纸片贴在含菌平板上,每种菌做3块重复平板。平板先在4℃中保存1h让药物渗入培养基,然后将细菌平板置于37℃的恒温培养箱中培养24h,真菌用28℃培养72h,取出平板观察抑菌圈。2.2果皮的抑菌效果测定用试管将干燥的黑老虎果皮圆片分别置于40,60,80和100℃恒温水浴锅中保温20min,另取一份果皮样品于120℃的高压灭菌锅中处理20min,用滤纸片法观察不同温度处理的果皮对伤寒沙门氏菌的抑菌效果。2.3果皮提取物的制备采用二倍稀释法测定黑老虎果皮乙醇提取物的最小抑菌浓度。取10支各装有1mlM-H液体培养基的无菌试管进行编号。其中,1～8号管配成含一定浓度梯度果皮提取物的培养基,1号管加入1ml乙醇提取物(含生药1g/ml),充分混匀后取出1ml加入2号管,2号管充分混匀后又取出1ml加入3号管,依次类推到8号管,稀释后1～8号管的果皮提取物含量分别为500,250,125,62.5,31.25,15.63,7.81,和3.91mg生药/ml。9号管为不加药物的阳性对照,1～9号管分别接种伤寒沙门氏菌悬液0.1ml,10号管为不接种的阴性对照,各处理均做3个平行管。所有试管置于37℃的恒温箱中培养24h后观察结果,在9号阳性对照管出现混浊,而10号阴性对照管呈透明状的前提下,观察1～8号管的浑浊状况,以不出现混浊的最低浓度为最小抑菌浓度。2.4最小杀菌浓度测定取上述培养好的各管菌悬液0.1ml,分别均匀涂布于M-H琼脂平板培养基上,晾干后置于37℃的恒温箱中培养24h,观察菌落生长情况,以不长菌落的最低浓度为最小杀菌浓度。2.5乙醇提取与抑菌依次用等体积的石油醚、乙醚、正丁醇、醋酸乙酯和丙酮萃取上述所获得的乙醇提取液,各相萃取液均在40℃下减压浓缩至相当于含生药1g/ml的浓度,并用滤纸法进行对伤寒沙门氏菌的抑菌试验,检测果皮的抑菌成分主要存在于哪一有机相中。3结果3.1果皮的抑制作用首先直接用干燥的黑老虎果皮圆片进行抑菌实验。在受试的6种菌中,果皮对伤寒沙门氏菌有明显的抑制作用(图1),而对其他5种菌无明显的抑制效果。图1中可见,果皮的抑菌圈小于阳性滤纸片(含头孢氨苄),但果皮的抑菌圈很清晰而且重现性好。3.2抑菌圈的大小经100℃和100℃以下温度处理的果皮对伤寒沙门氏菌均有抑制作用,从抑菌圈的大小判断,各处理的抑菌效果相当,经120℃处理后的果皮则丧失抑菌能力。结果说明黑老虎果皮所含的抑菌成分在100℃以下不被破坏,具有较好的热稳定性。3.3果皮提取物抑制法不同浓度的果皮提取液对伤寒沙门氏菌的抑菌和杀菌效果见表1。1～5号试管的液体培养基保持透明状态,说明细菌的生长受到果皮提取物的抑制,最小抑菌浓度出现在5号试管,相当于含生药31.25mg/ml。当这些培养液转接到平板后,药物浓度被稀释,4,5号平板长出菌落,说明这个浓度只能抑制而不能杀死伤寒沙门氏菌。最小杀菌浓度出现在3号试管,相当于含生药125mg/ml。3.4苹果树叶片生长图将黑老虎果皮的乙醇提取液和各段萃取液用于滤纸片抑菌试验。结果如图2。可以清楚的看到,只有乙醇提取液(图2-1)和乙醚萃取相(图2-3)有抑菌作用,黑老虎果皮抑菌成分主要存在于乙醚相中,经乙醚萃取后的醇水相已经没有抑菌作用(图2-4)。4皮对伤寒沙门氏菌的抑菌作用对黑老虎的药效作用已有一些研究,如:刘锡钧等从黑老虎根部分离得一种天然化合物晶I,药理实验证明有一定镇静和消炎作用;朱树凡研究了中药黑老虎对大鼠肝损伤的保护作用等。但关于黑老虎抑菌作用的研究却很少,只有袁婷等研究了黑老虎根的抑菌作用,发现黑老虎根的水浸提液可以抑制肺炎球菌。本研究发现了黑老虎果皮对伤寒沙门氏菌的抑菌作用,两项研究结果说明黑老虎的根和果皮中所含抑菌成分可能不是同一物质。从本研究得知黑老虎果皮的抑菌成分极易溶于乙醚,其极性与乙醚相似,而且可以耐受100℃的高温,具有较好的热稳定性,该成分的化学结构和其他理化性质还有待于进一步研究。伤寒沙门氏菌是肠杆菌科的致病菌,该菌通过食物进入人体肠道,其内毒素可引起胃肠炎、肠热症、伤寒和副伤寒等症。近年来,伤寒沙门氏菌对抗生素的耐药性呈上升态势。本研究发现,黑老虎果皮可以抑制伤寒沙门氏菌的生长,高浓度时可以杀死该菌,具有进一步研究和开发的价值。另外,黑老虎果皮对伤寒沙门氏菌的抑菌作用与