温度对感染期幼虫生存及死亡的影响

温度对感染期幼虫生存及死亡的影响

广州管虫是一种食源性寄生虫，主要流行于太平洋、印度洋的一些岛屿和东南亚国家。在中国大陆地区,自1984年由何竟智等报道我国首例广州管圆线虫病之后,病例报道越来越多,并逐渐由南向北扩散。特别是2006年6-9月,北京暴发群体广州管圆线虫病,患者达160多例。广州管圆线虫病日益成为威胁我国人民健康的重大传染病之一,引起了我国卫生管理部门及卫生工作者的注意。卫生部在2003年将广州管圆线虫病列为我国新发疾病。人体感染广州管圆线虫病主要是食用了含有该虫第3期幼虫的螺类、鱼、虾以及被第3期幼虫污染的蔬菜、瓜果和饮水。因此,在食用螺类、鱼、虾等食物之前,充分煮熟食物非常重要。但究竟多少温度才能杀灭广州管圆线虫感染期幼虫至今未见详细报道。本研究较详细地探讨了温度对广州管圆线虫感染期幼虫的杀灭作用,为防治广州管圆线虫病提供了理论依据。1材料和方法1.1材料表面1.1.1不同肉泥的制备广州管圆线虫感染期幼虫来源于广州市番禺区自然感染的褐云玛瑙螺。取新鲜褐云玛瑙螺洗干净,击破,去壳,剁碎成肉泥。加入人工消化液(消化液成分:蒸溜水100ml,胃蛋白酶0.2g,盐酸0.7ml)消化,取沉淀物置玻璃平皿内,解剖镜下挑取活动良好的感染期幼虫,分装于小培养皿内,置5℃冰箱中备用。1.1.2温度调节至不同温度的温度35、30、20、20、20、20、20、20、20、20、20、20电热恒温水箱(CU600型,上海一恒科学仪器有限公司生产,制造编号:0811226),调节至35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃的不同温度。在水浴箱里面放入1个装满清水的大培养皿及数个小培养皿(小培养皿内预先装有约1ml清水),预热30min。1.2生物测定和计数将广州管圆线虫感染期幼虫分组,25条/组。每个温度分别加热1min、5min、10min、15min、20min,同时每个时间段做3个平行组,计算平均数。每个实验组加热到预定时间后,迅速加入适量碎冰块或冰水,取出小培养皿置于冰水中,使培养皿内液体冷却至室温以下,以终止温度对幼虫的继续作用。将培养皿置于解剖镜下计数,记录生存和死亡的幼虫数目。设立对照组,幼虫放于自来水中,置室温内观察。1.3解剖剖相法幼虫生存和死亡判断标准:死亡幼虫:幼虫形态僵硬,呈“l”、“C”字形或僵硬“O”字形,虫体不活动,或改变温度、用解剖针碰触没有反应,判断死亡。生存幼虫:幼虫柔软卷曲,呈螺旋状、波浪状、“6”字形或不规则形,虫体活动,判断存活。1.4统计分析实验数据采用MicrosoftOfficeExcel2007建立数据库并进行统计分析。2结果2.1控制不同温度对幼虫死亡率的影响在解剖镜下观察,温度35~45℃、作用1~20min时,感染期幼虫活动状态良好,未发现有幼虫死亡的现象,幼虫死亡率为0。幼虫活动状态与实验前相比无明显变化,温度对幼虫没有杀灭作用。温度为50~65℃时,个别幼虫开始死亡,死亡率为12.00%~100%。温度为70~75℃时,大部分幼虫死亡,但加热时间较短的时候,仍有极少数幼虫存活,死亡率为97.22%~100%。80℃以上温度时,全部幼虫死亡,死亡率为100%(表1)。2.2温度对幼虫的药效试验在1~20min内,45℃以下温度对幼虫不具有杀灭作用,幼虫死亡率为0。50℃以上,1min温度开始对幼虫具有杀灭作用。温度对幼虫的杀灭作用,随着温度的升高而增强,加热时间越长,杀灭作用越明显,幼虫死亡率越高。80℃以上温度时,对幼虫具有完全杀灭作用,幼虫迅速死亡,死亡率为100%(图1)。2.3对照组感染期的幼虫在1~20min内,幼虫活动情况良好,死亡率为0。3温度对广州管圆线虫感染期幼虫死亡率和作用时间的影响温度对广州管圆线虫感染期幼虫具有杀灭作用,其杀灭作用与温度的高低以及作用时间的长短有关。本研究结果表明,在45℃以下温度,作用时间1~20min,对广州管圆线虫感染期幼虫没有杀灭作用。当温度上升到50℃时,作用时间1min,感染期幼虫开始死亡,但死亡率十分低,仅12.00%。随着作用时间的延长,在同样温度(50℃)下,作用时间为5~20min时,感染期幼虫死亡数量逐渐增加,死亡率逐渐增高至20.00%~59.72%。同样,随着温度的升高,感染期幼虫死亡率也在增高,如温度在55℃、60℃、65℃、70℃和75℃时,除了55℃,10min,死亡率稍高于作用15min的死亡率以及75℃,作用1min,稍高于作用10min的死亡率之外,其余情况均是这样。当温度上升到80℃以上时,全部感染期幼虫迅速死亡,死亡率为100%,温度与感染期幼虫死亡率的关系就更加明显。因此可以认为,温度对广州管圆线虫感染期幼虫的杀灭作用,温度越高,作用时间越长,杀灭作用越强。本研究结果也表明,广州管圆线虫感染期幼虫的死亡率除了与温度的高低和作用时间的长短有关外,还可能与感染期幼虫的个体差异有关。从研究结果可以看出,有极个别感染期幼虫在相同温度条件下,作用时间长的死亡率反而低于作用时间短的感染期幼虫,如温度55℃、作用15min、死亡率为73.42%,低于作用10min、死亡率为82.67%;更明显的是温度60℃,作用15~20min,感染期幼虫死亡率是100%,而温度65℃,作用1~20min,死亡率反而更低,为70.90%~98.55%;极个别感染期幼虫甚至在温度到达70℃,作用1min;以及在温度75℃,作用1min和10min还没有被杀灭,说明这极个别感染期幼虫对温度的耐受能力比较强,存在个体差异。何竟智等(1993)用60℃温度处理感染期幼虫,幼虫死亡时间是2min。而本研究在同样温度条件下观察到的幼虫死亡时间更早,从1min开始幼虫已经有57.39%死亡。这也间接说明感染期幼虫对温度的耐受能力存在个体差异。这种差异是由虫体本身造成的还是虫体发育不同阶段所致?张超威(2008)在观察福寿螺体内广州管圆线虫Ⅲ期幼虫的形态学特征时,观察到有一些Ⅲ期幼虫出现了Ⅳ期幼虫的早期特征,认为这可能与个体差异有关。本研究所观察到的这极个别幼虫会不会是出现了Ⅳ期幼虫早期特征的幼虫,因而能够抵抗更高的温度还有待进一步观察研究。本研究结果还表明,当温度达到80℃以上时可以在很短时间内杀灭全部感染期幼虫。但这并不表示人们在食用螺类的时候,只要把螺类加温到80℃时就可以安全食用了。值得注意或提醒的是,由于感染期幼虫都是寄生在螺体内,而且有螺肉的保护,温度对感染期幼虫的实际杀灭作用会相应的减弱,因此,在现实生活中食用螺肉时需要更高的温度或需要更长的时间,才能杀灭螺肉内的感染期幼虫。有报道指出,在烹调螺肉的过程中加入的一些调味品也有助于杀灭幼虫。极低浓度的酱油对幼虫杀灭作用明显,但50%醋和25%乙醇对广州管圆线虫第Ⅲ期幼虫活动抑制不明