洁净区环境测试操作规程

干净区环境测试操作规程颁发部门：质量部分发部门：生产部、设备部、质量部、采购部、仓储部、财务部一、目的：建立一种空气干净度监测原则操作规程，规范空气干净度监测操作程序，确保细胞生产干净车间的空气干净度符合GMP规定。二、范畴：合用细胞生产干净车间的空气干净度的监控。三、职责/根据：质量部负责该原则操作规程的制订，并监督制度的执行；质量确保部和质量控制部门负责该原则操作规程的实施；质量确保部门对进行监督与检查。四、程序/内容：1概述1.1干净厂房是指根据需要对空气的尘粒（涉及微生物）、风速、温湿度及压力等进行控制的密闭环境，其建筑构造、装备及其使用均含有减少该区域内污染源的介入、产生和滞留的功效，并以其空气干净度等级符合《药品生产质量管理规范》的规定。1.2干净厂房分为：D级、C级，B级、A级。我司细胞生产干净区为D级、C级和局部A级。2沉降菌测试2.1办法概述本测试办法运用沉降法，即通过自然沉降原理收集在空气中的生物粒子于培养基平皿，经48小时以上培养，在适宜的条件下让其繁殖到可见的菌落数，来评定干净环境内的活微生物数，并以此来评定干净室（区）的干净度。2.2所用设备及仪器高压灭菌锅：使用时严格按照操作规程使用恒温培养箱：定时对培养箱温度进行检定2.3培养皿：普通采用ф90mm×15mm玻璃培养皿。2.4培养基：普通营养琼脂培养基将培养基加热熔化，冷却至约45℃，在无菌操作条件下将培养基注入培养皿，每皿约15ml。待琼脂培养基凝固后，将培养皿放入30~35℃恒温培养箱中培养48小时，若培养基平皿上确无菌落生长，即可供采样用，制备好的培养皿应在2~8℃的环境中寄存。2.5测试环节1）采样①将已制备好的培养皿放置在预先拟定的取样点，然后从里到外逐个打开培养皿盖，使培养基表面暴露在空气中。②静态测试时，培养皿暴露时间为30分钟以上；动态测试时，培养皿暴露时间为4小时，单个沉降碟的暴露时间能够少于4小时，同一位置可使用多个沉降碟持续进行监测并累积计数。③全部采样结束后，将培养皿盖上盖子，倒置放置。2）培养①全部采样结束，将培养皿倒置于恒温培养箱中培养。②在30~35℃培养，时间不少于72h。③每批培养基应有对照实验，检查培养基本身与否污染，可每批选定3只培养皿作对照培养。3）菌落计数①用肉眼直接计数。②若培养皿上有2个或2个以上菌落重叠，可分辨时仍以2个或2个以上的菌落计数。2.6注意事项1）测试用品要做灭菌解决，以确保测试的可靠性、精确性。2）采用一切方法避免人为对样本的污染。3）对培养基、培养条件及其它参数作具体的统计。4）由于细菌种类繁多、差别甚大，计数时普通用透射光于培养皿背面或正面认真观察，不要漏计培养皿边沿生长的菌落，并须注意细菌菌落与培养基沉淀物的区别，必要时用显微镜鉴别。5）采样前应认真检查每个培养皿的质量，如发现变质、破损或污染的应剔除。2.7测试规则1）测试状态①沉降菌测试前，被测试干净室（区）的温湿度须达成规定的规定，压差必须控制在规定值内。②沉降菌测试前，被测试干净室（区）已通过消毒。③测试状态有静态和动态两种，状态的选择必须符合生产的规定，并在报告及统计中注明测试状态。2）测试人员①测试人员必须穿戴符合环境干净度级别的工作服。②静态测试时，室内测试人员不得多于2个人。3）测试时间①静态测试时，干净厂房的空气净化调节系统的风机启动30分钟后开始测试。②动态测试，在生产人员处在正常生产状态下进行的测试。③对单向流，测试应在净化空调系统正常运行不少于10分钟后开始。④对非单向流，测试应在净化空调系统正常运行不少于30分钟开始。4）沉降菌计数①采样点数目及布置：采样点布置参考图1，工作区测试点位置离地0.8~1.5m左右（略高于工作面）。②最少采样点数目，沉降菌的最少采样点数可按表1拟定。③可在核心设点或核心工作活动范畴处增加测点，采样点的布置应力求均匀，避免采样点在某局部区域过于集中，某局部区域过于稀疏。图1沉降菌采样点数目及布置图表1最低程度采样点数面积(m2)干净级别A级B级C级D级<102～32～32210≤S＜20442220≤S＜40882240≤S＜100161642100≤S＜2004040103200≤S＜4008080206400≤S＜100016016040131000≤S＜4004001003280080020063注:表中面积，对于单向流(层流)干净室,是指送风面面积；对于乱流干净室，是指房间面积。2.8统计：测试报告中应统计房间测试状态及测试数据。2.9成果计算1）用计数办法提出各个培养皿的菌落数。2）平均菌落数的计算见下式：平均菌落数m=QUOTEEQ\F(m1+m1+……+mn,n)式中：m为平均菌落数；m1为1号培养血菌落数；m2为2号培养皿菌落数；mn号培养皿菌落数；n为培养皿总数。3）动态监测时，如果培养皿暴露时间不大于4小时，最后的菌落计数（cfu／4h）应为：最后菌落计数M=m/实际暴露时间×4式中：m为平均菌落数；M为最后累计4小时菌落计数。2.10成果评定：用平均菌落数判断干净室的空气中的微生物。1）干净室（区）内的平均菌落数必须低于所选定的评定原则，见表3。表3评定原则干净级别A级B级C级D级原则（平均）cfu/4小时<15501002）若某干净室（区）较平均菌落数超出评定原则，则必须对此区域先行消毒，然后重新测试两次，测试成果必须符合规定。3.尘埃粒子测试3.1概述：干净区悬浮粒子监测采用计数浓度法，即通过测定干净区环境内单位体积空气中含某粒径的悬浮粒子数，来评定干净室（或干净区）的悬浮粒子干净度等级。3.2仪器：Metone-3400型微尘粒子计数器。3.3监测原理：空气中悬浮粒子在光的照射下产生光散射现象，散射光的强度与粒子的体积成正比。3.4Metone-3400型微尘粒子计数器使用要点。1）使用仪器时应严格按照《Metone-3400型微尘粒子计数器原则操作规程》进行操作。2）仪器开机预热至稳定后，方可按阐明书的规定对仪器进行设立。3）采样管口置采样点采样时，在确认计数稳定后方可开始持续读数。4）采样管必须干净，严禁渗漏。5）采样管的长度应根据仪器的允许长度。除另有规定外，长度不得不不大于1.5m。6）计数器采样口和仪器工作位置应处在同一气压和温度下，以免产生测量误差。7）必须按照仪器的检定周期，定时对仪器作检定，以确保测试数据的可靠性。3.5测试规则1）测试条件①温度和湿度：干净室（区）的温度和相对温度应与其生产及工艺规定相适应（温度控制在18~26℃，相对湿度控制在45~65%之间为宜）。②压差：有干净级别规定的干净室（区）相对非干净室（区）的压差应不不大于10Pa，空气干净度不同的干净室（区）之间的压差应不不大于10Pa，空气干净度等级相似的区域，产尘量大的操作室应保持相对负压（≤-5Pa）。2）测试状态①静态测试：干净室（区）净化空气调节系统已处在正常运行状态，工艺设备已安装，干净室（区）内没有生产人员的状况下进行测试，静态测试时，室内测试人员不得多于2人。②动态测试：干净室（区）已处在正常生产状态下进行测试。③测试报告中应标明测试时所采用的状态。3）测试时间①对单向流测试应在净化空气调节系统正常运行时间不少于10min后开始。②对非单向流测试应在净化空气调节系统正常运行时间不少于30min后开始。4）悬浮粒子计数①采样点数目及其布置A、最少采样点数目：悬浮粒子干净度测试的最少采样点数目能够按照表1拟定。B、采样点的布置a、采样点普通在离地面0.8～1.5m高度的水平面上均匀布置。B、采样点的布置还可根据需要在生产及工艺核心操作区增加采样点。②采样点的限定：对于任何干净室面积较小或局部空气净化区域，采样点的数目不得少于2个，总采样次数不得少于5次。每个采样点的采样次数能够多于1次，且不同采样点的采样次数能够不同。普通状况下，测点的位置以下图2所示：注：为采样点。③采样量：不同干净级别每点·最小的采样量，见表5。表5不同干净级别每点最小采样量干净级别采样量（L/次）A级1000B级1000C级100D级100④采样注意事项A、在确认干净室（区）压差达成规定后，方可进行采样。B、对于单向流，计数器采样管口朝向应正对气流方向，对于非单向流，采样管口垂直向上。C、当采样点与设备重叠时，可取消该采样点（在确保最少采样点数目的前提下），或将采样点设在设备的上风侧。D、布置采样点时，应避开回风口。E、采样时测试人员应站在采样口的下风侧。3.6成果计算：悬浮粒子浓度的采样数据应按下述环节统计计算1）以测试打印的数据为根据进行计算。2）打印数据上应涉及的内容：采样点（A）、采样次数（L）、年月日、测试时间、测量周期（F）、粒径（含0.5µm和5µm）及测试数据、每M3空气中的粒子数、UCL值、级别。B1+B2+…+BB1+B2+…+BNNA=A=式中：A：某一采样点的平均粒子浓度（粒∕m3）N：某一采样点的采样次数Bi：某一采样点的粒子浓度（i=1，2，3…N）粒∕m3A1+AA1+A2+…+ALLM=式中：M：平均值的均值，即干净室（区）的平均粒子浓度，粒∕m3。Ai：某一采样点的平均粒子浓度（i=1，2，3…L），粒∕m3。L：某一干净室（区）的总采样点数，个。5）原则误差式中：SE：平均值均值的原则误差，粒∕m3。6）置信上限UCL=M+t×SE式中：UCL：平均值均值的95%置信上限，粒∕m3；t：95%置信上限的t分布系数，见表6。表6t分布系数表采样点数L23456789＞9t6.312.922.352.132.021.941.901.86----备注：在采样点只有1个，或多于9个时，不用计算95%置信上限。7）打印取值范畴①A级干净度打印取值范畴：采样量1000升，采样时间10分钟，取三次打印值按以上公式进行计算。②C级干净度打印取值范畴：粒子的采样量100升，采样时间1分钟，取三次打印值按以上公式进行计算。③D级干净度打印取值范畴：粒子的采样量100升，采样时间1分钟，取三次打印值按以上公式进行计算。3.7成果评定：判断悬浮粒子干净度级别应根据下述两个条件：1）每个采样点的平均粒子浓度必须低于或等于干净级别规定的级别界限，即A≤级别界限。2）全部采样点的粒子浓度平均值均值的95%置信度必须低于或等于规定的级别界限，即UCL≤级别界限。3.8悬浮粒子级别界限(见表7)：表7悬浮粒子级别界限干净级别悬浮粒子最大允许数（粒/M3）静态动态≥0.5µm≥5µm≥0.5µm≥5µmA级352020352020B级352029352900C级352900≤350≤29000D级35029000不作规定不作规定3.9报告：根据检测的数据进行计算后，填写“悬浮粒子检测统计”和“悬浮粒子检测报告书”。4浮游菌测试4.1办法概述本办法采用计数浓度法，即通过收集悬游在空气中的生物性粒子于专门的培养基，经48小时后，在适宜的生长条件下让其繁殖到可见的菌落进行计数，从而鉴定干净环境内单位体积空气中的活微生物数，以此来评定干净室（区）的干净度。4.2所用的仪器和设备1）高压消毒锅：使用时应严格按照操作规程进行。2）恒温培养箱：必须定时对培养箱的温度计进行检定。3）浮游菌采样器：MAS100NT空气浮游菌采样器。4.3空气采样量：根据需要选定，已知采样器的流量（L/min），设定采样时间（min），两者相乘即采样量（L）。4.4注意事项1）采样口必须用便于消毒及化学性能稳定的材料制造。4.5测试环节1）测试前仪器、培养皿表面必须严格消毒。2）采样者应穿戴与被测干净区域对应的工作服，在转盘上放入或调换培养皿前，双手用消毒剂消毒。3）全部采样结束后，将培养皿倒置于恒温培养箱中培养。在30～35℃培养箱中培养，时间不少于48h。4）每批培养基应有对照实验，检查培养基本身与否污染。可每批选定3只培养皿作对照培养。4.6测试规则1）测试状态①浮游菌测试前，被测试干净室（或干净区）温、湿度须达成规定的规定，静压差、换气次数、空气流速必须控制在规定值内。②浮游菌测试前，被测试干净室（或干净区）已通过消毒。③测试状态有静态和动态两种，测试状态的选择必须符合生产的规定，并在报告中注明测试状态。2）测试人员①测试人员必须穿戴符合环境级别的工作服。②静态测试时，室内测试人员不得多于2人。3）测试时间①对单向流，测试应在净化空调系统正常运行不少于10min后开始。②对非单向流，测试应在净化空调系统正常运行不少于30min后开始。4）浮游菌浓度计算①采样点数量及其布置A、最少采样点数目：悬浮粒子干净度测试的最少采样点数目能够按照表1拟定。B、采样点的位置：采样点位置能够同悬浮粒子测试点。a、工作区测点位置离地0.8m～1.5m左右（略高于工作面）。b、可在核心设备或核心工作活动范畴处增加测点。②最小采样量：采样量根据日常检测及环境证明，每次最小采样量见表9。表9浮游菌测试最少采样量干净级别采样量L/次A级1000LB级1000LC级500LD级100L③采样次数：每个采样点普通采样一次。④采样注意事项A、对于单向流或送风口，采样器采样管口朝向应正对气流方向；对于非单向流，采样管口向上。B、布置采样点时，最少应离开尘粒较集中的回风口1m以上。C、采样时，测试