微生物方法验证报告

报告审核同意:ReportReview/ApprovalSignatures报告审核/同意签字Date日期Draftedby/起草人Reviewedby/审核人Approvedby/同意人目录目的……………..………………...3介绍与汇总……………………….3样品、仪器、培养基及稀释液………………….4细菌、霉菌及酵母菌计数办法的验证………….4控制菌检查办法验证……………..6总结………………...7偏差………………...7附录A:****胶囊(规格10mg)微生物程度检查办法….……..8目的通过对生产工艺和辅料发生变更后的***胶囊(规格10mg)微生物程度检查的验证，确认所采用的办法适合于该药品的微生物程度的测定,以证明所设定的检查条件及检查程序对可能存在的各类微生物无克制作用，确保检查成果的真实性和重现性。介绍与总汇***胶囊(规格10mg)微生物程度检查中计数办法验证细菌、霉菌及酵母菌采用平皿法（1ml/皿）；控制菌检查办法验证采用常规法（10ml供试液加入到100mlBL培养基中）。为证明此办法能消除***胶囊(规格10mg)的抑菌活性及测定办法的可靠性，QC按照方案（文献编号：VP9023-01）对微生物程度检查办法进行验证。办法验证内容涉及：细菌、霉菌及酵母菌计数办法验证、控制菌检查办法验证。验证成果证明：该检查办法和检查条件能消除***胶囊(规格10mg)的抑菌活性，符合微生物程度检查办法验证规定。日常检测按验证的办法和条件进行微生物程度检查。计数办法验证及控制菌办法验证成果汇总见下表：验证时间样品批号规格验证成果计数办法验证（菌回收率%）控制菌验证大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉菌-10-26070110mg87.795.5113.789.0115.7实验组检出实验菌，供试品组、阴性对照呈阴性，无抑菌活性。-10-26070210mg87.789.2104.890.692.1实验组检出实验菌，供试品组、阴性对照呈阴性，无抑菌活性。-10-26070310mg101.977.8111.692.896.1实验组检出实验菌，供试品组、阴性对照呈阴性，无抑菌活性。办法验证成果汇总样品、仪器、培养基及稀释样品***胶囊规格：10mg批号：0701、0702、0703仪器仪器名称型号编号生产厂家生化培养箱LRH-250FA0054上海一恒科技有限公司霉菌培养箱MJ-250-ⅡA0052上海一恒科技有限公司培养基名称干粉批号生产厂家营养琼脂培养基0210北京奥博星生物科技有限公司玫瑰红钠琼脂培养基0210北京奥博星生物科技有限公司营养肉汤培养基0406北京奥博星生物科技有限公司改良马丁琼脂培养基101028北京三药生物科技有限公司胆盐乳糖培养基0115北京奥博星生物科技有限公司4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基091029北京三药生物科技有限公司培养基稀释液PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液0.9%无菌氯化钠溶液含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液细菌、霉菌及酵母菌计数办法的验证菌种菌种菌种序列号代次菌种来源大肠埃希菌CMCC（B）44102第3代四川省药品检检所金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003第5代四川省药品检检所枯草芽孢杆菌CMCC（B）63501第3代四川省药品检检所白色念珠菌CMCC（F）98001第5代四川省药品检检所黑曲霉菌CMCC（F）98003第5代四川省药品检检所菌液制备及同时计数将制备好的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌菌悬液用0.9％无菌氯化钠溶液做10倍系列稀释制成每1ml含菌数50～100CFU的工作菌液；黑曲霉的新鲜培养物用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液将孢子洗脱，并做10倍系列稀释制成每1ml含孢子数50～100CFU的孢子菌液。取工作菌液1ml用平皿法做活菌计数。计数成果见下表：菌种成果（CFU/ml）平均值（CFU/ml）稀释级皿1皿2大肠埃希菌10-6757977金黄色葡萄球菌10-6827679枯草芽孢杆菌10-6697773白色念珠菌10-5899290.5黑曲霉菌10-5676063.5供试品制备：称取***胶囊(规格10mg)5g，加PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至50ml，45℃水浴10分钟，取出混匀，即为1：10供试液。根据验证方案（文献编号：VP9023-01）规定对***胶囊(规格10mg)计数办法验证，细菌、霉菌及酵母菌计数办法验证采用平皿法（1ml/皿），3次独立实验中，各实验菌的回收率成果见下表：验证起止时间样品批号菌种成果菌液组实验组回收率（%）供试品组阴性对照组-10-26～-10-310701大肠埃希菌7767.587.700金黄色葡萄球菌7975.595.5枯草芽孢杆菌7383113.7白色念珠菌90.580.589.000黑曲霉菌63.573.5115.7验证起止时间样品批号菌种成果菌液组实验组回收率（%）供试品组阴性对照组-10-26～-10-310702大肠埃希菌7767.587.700金黄色葡萄球菌7970.589.2枯草芽孢杆菌7376.5104.8白色念珠菌90.58290.600黑曲霉菌63.558.292.1-10-26～-10-310703大肠埃希菌7778.5101.900金黄色葡萄球菌7961.577.8枯草芽孢杆菌7381.5111.6白色念珠菌90.58492.800黑曲霉菌63.56196.1计数办法验证明验结论：通过采用平皿法（1ml/皿）对3批样品进行细菌、霉菌及酵母菌计数办法验证，实验成果表明：供试品组检查合格、阴性对照组无菌生长、实验组各菌的回收率均高于70%，无抑菌活性，符累计数办法验证的规定。故可按此检查办法和条件对***胶囊(规格10mg)进行细菌、霉菌及酵母菌检查。控制菌检查办法验证菌种菌种菌种序列号代次菌种来源大肠埃希菌CMCC（B）44102第3代四川省药品检检所菌液制备及计数见计数办法验证中的菌液制备及计数成果见4.2。根据验证方案（文献编号：VP9023-01）规定对***胶囊(规格10mg)采用常规法对控制菌检查办法进行实验（10ml加入到100ml的胆盐乳糖培养基中），3次独立实验中，实验组、供试品组及阴性对照组验证成果以下表：验证起止时间样品批号项目成果实验组供试品组阴性对照组-10-26～-10-280701MUG培养基＋－－靛基质试剂＋－－-10-26～-10-280702MUG培养基＋－－靛基质试剂＋－－-10-26～-10-280703MUG培养基＋－－靛基质试剂＋－－控制菌检查办法实验结论：在3次独立实验中，控制菌检查办法验证采用常规法（10ml供试液加入到100mlBL培养基中）进行实验，实验成果表明：实验组检出实验菌，供试品组、阴性对照组呈阴性，无抑菌活性，符合控制菌验证规定。故可按此检查办法和条件对***胶囊(规格10mg)进行控制菌检查。总结通过对3批样品验证，细菌、霉菌及酵母菌计数验证采用平皿法（1ml/皿），控制菌检查验证采用常规法（10ml供试液加入到100mlBL培养基中），实验成果表明：计数办法验证各实验菌的回收率均高于70%，控制菌检查实验组检出实验菌，供试品组、阴性对照组呈阴性，无抑菌活性，符合微生物程度检查验证规定，日常检测按此检查办法和条件进行微生物程度检查。偏差无附录A***胶囊(规格10mg)微生物程度检查办法细菌、霉菌及酵母菌计数培养基及试液营养琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液供试液制备称取供试品5g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至50ml，45℃水浴10分钟，取出混匀，即为1：10的供试液。操作取1：10的供试液各1ml至Ф90mm的培养皿中，然后加入15ml～20ml已融化好并冷却至约45℃的适宜培养基。细菌数用营养琼脂培养基，霉菌及酵母菌数用玫瑰红钠琼脂培养基，每种培养基平行制备2皿。培养倒置培养，细菌的培养温度为30℃～35℃，培养3天。霉菌及酵母菌的培养温度为23℃～28℃大肠埃希菌检查培养基及试液胆盐乳糖培养基（BL）4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）麦康凯琼脂培养基（MacC）或曙红亚甲蓝琼脂培养基(EMB)0.9%无菌氯化钠溶液操作取胆盐乳糖培养基3瓶，每瓶100ml。1瓶加入供试液10ml（供试液制备见1.2），混匀；1瓶加入供试液10ml及含菌数为10CFU～100CFU大肠埃希菌的工作菌液，混匀，做为阳性对照；另1瓶加入稀释剂10ml做为阴性对照，混匀。30℃～35℃培养18～24小时。必要时可延长至取上述培养物0.2ml，接种至含5mlMUG培养基的试管内，30℃～35℃培养，于5小时、24小时在366nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照观察。若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性