微生物实验室常用菌种的维护与管理

微生物实验室常用菌种的维护与管理

在微生物实验室，通常需要保存一些常见的细菌和菌株，如金色细菌、引起性细菌、几种常见的沙门氏菌和流行性疾病。学生们进行了细菌涂片染色、细菌接种和制备、凝集原生动物、免疫动物和制备血清和测定血清效率等。在做抗菌药物敏感试验时,也需常备一套对各种抗菌药物“敏感”的对照菌株,使学生学会判断细菌对药物的敏感性。对这些菌种的妥善保管和保存,是良好的实验室管理和实验质量的重要保证。1保存由于实验室中保存的菌种大多对人体具有致病性,经多次移种又易被污染和发生变异,做好安全及质量管理至关重要,主要应做到以下几点。1.1专业人员负责菌种保管应指定专人负责,存放于加锁的冰箱中。保管人应具备高度的责任心,明确职责,严格执行有关的规章制度,以确保菌种安全。1.2菌种的名称和数量实验室应备有一本详细登记本,对各种菌种进行详细登记,内容包括菌种的名称,编号,数量,分离日期,鉴定者,细菌的形态染色,培养生化特性,抗原结构,动物致病力等,并注明使用、移种及销毁的情况和原因。1.3菌种移种时间对菌种的保管不仅要求菌种不死,还要力求其生物学性状等不发生变异。各种菌种应按规定时间定期移种。细菌在人工培养基上经数代培养后,其形态、菌落、毒力等均易发生变异,因此,在每移种3次后应做一次全面鉴定,检测菌种有无污染和变异,如发现污染和变异时,应及时处理。2保存保存菌种应根据细菌的培养特性、抵抗力等选择适合的培养基,微生物实验室常用菌种的一般保存方法有以下几种:2.1立辊储存法2.1.1接种传代1次肠道杆菌、葡萄球菌等营养要求不高的细菌可接种于普通琼脂斜面上,斜面底部应加少许无糖肉膏液,以防干涸(但变形杆菌“OX”及伤寒杆菌“0”菌株宜接种于斜面底部无肉汤的干燥的琼脂斜面,以防变异),用橡皮塞塞紧,置37℃培养18～24h后,放于4℃冰箱中,可保存1个月,每经1个月需接种传代1次。2.1.2接种1个月2个月链球菌及肺炎球菌的营养要求较高,在普通培养基上生长不良或不生长,应接种于血液琼脂斜面上,37℃培养生长后,放4℃冰箱保存,链球菌需半个月～1个月接种1次;肺炎球菌因能产生自溶酶而导致自溶现象,需4d移种1次。肺炎球菌在人工培养基上经数代培养后,其形态、菌落、毒力均易发生变异,在人工培养基上肺炎球菌很快失去荚膜,经多代培养后其光滑型菌落可变为粗糙型,毒力也大为降低。2.1.3vi产物的毒力成分为新鲜全蛋、1%葡萄糖肉汤及甘油。少数沙门氏菌当新从病人检材中分离出来时,常具有Vi抗原,具有Vi抗原的细菌,有抵抗吞噬的作用,并保护细菌不被相应抗体在补体参与下所溶解,故毒力较强。含有Vi抗原的沙门氏菌等,可接种于鸡蛋斜面上,37℃培养18～24h,加无菌液体石蜡至斜面浸没,再超出约1cm,置4℃冰箱,可保存3～6个月,Vi抗原经长期人工培养,也易消失。2.1.4血清“制备”白喉杆菌可保存在该培养基上,其成分为1%葡萄糖肉汤(pH7.4)1份,牛血清或兔血清(无菌)3份。白喉杆菌在此培养基上生长迅速、旺盛,菌体形态典型,如在培养基中再加入5%～10%的中性甘油,则培养出的白喉杆菌的异染颗粒更为明显,但24h后即衰老成为多形态,很少有异染颗粒,菌体粗大3～4倍,置4℃冰箱可保存2周～1个月。2.2半固体穿刺保护法2.2.1液体石蜡的传代移种大肠杆菌、葡萄球菌、绿脓杆菌等可穿刺接种于普通半固体培养基内,37℃培养18～24h后,加1层无菌的液体石蜡,厚度约为1cm,置4℃冰箱可保存3～6个月。传代移种时,将半固体菌种管倾斜,使液体石蜡流至一边,再取菌移种于新的培养基。将沾有少数液体石蜡的接种环浸于95%酒精中片刻,再烧灼灭菌,以免直接在酒精灯下烧灼时,液体石蜡四溅,引起污染。2.2.2结核杆菌培养基结核杆菌的营养要求较高,在培养基中需加入复杂的有机物如动物血清、鸡蛋、马铃薯、氨基酸以及磷、硫、钾、镁等无机盐类才能生长。结核杆菌的培养基种类很多,实验室最常用的是罗氏培养基。该菌生长速度很慢,一般分裂速度为18h1代,37℃需培养2～3周,置4℃冰箱可保存2～3个月。2.4厌氧菌的保存将牛肉渣装于试管中,高约3cm,并加入肉汤约5mL,比肉渣高1倍,在每管液面上加入已溶化的凡士林,高约0.5cm,高压灭菌后备用。破伤风杆菌等专性厌氧菌常保存在庖肉培养基内。使用时先将培养基置于水浴中煮沸10min,以驱除管内存留的氧气,然后将破伤风杆菌接种于肉渣培养基内,经37℃培养2～7d后,培养基呈轻度均匀混浊,肉渣部分消化,微变黑,产生少量气体,4℃冰箱可保存2～3个月。2.5培养基的制备适用于有芽胞的细菌的保存,将过筛后的中性细砂烘干,装入小试管内约lcm高,橡皮塞塞紧,灭菌烘干备用。用无菌生理盐水洗下培养基上的细菌培养物,制成悬液。吸此菌液约0.5mL注入砂管内,以砂土全部被浸湿为度。塞好管塞,放人干燥器内抽干。然后放在装有氯化钙(吸水剂)的干燥瓶内,置冰箱保存备用。需用菌种时,取一接种环砂土接种于适宜培养基上培养即可。2.6副溶血性弧菌回复突变型将细菌的普通培养基生长物放于4℃冰箱或室温冷暗处保存。用这种方法保存,只可保存数天,久之容易变异甚至死亡。一般只