北五味子和南五味子果实中化学成分的比较

北五味子和南五味子果实中化学成分的比较

五味子是著名的补药方剂。根据其所在地不同，可分为南五味子和北五味子，即木兰科植物的华尔五。味子SchisandrasphenantheraRehd.etWils.和五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果实。南五味子和北五味子的果实外形相似,都具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心等功效,用于治疗肺虚喘咳、自汗、盗汗等症,因而在中医传统用药时,南五味子和北五味子通用。然而传统认为北五味子的品质要高于南五味子,《本草纲目》上有“五味,今有南北之分,南产者色红,北产者色黑。入滋补药,必用北产者良”的记载。现代药理研究表明,南五味子和北五味子的主要药效成分都为脂溶性成分。目前,国内外有关北五味子和南五味子化学成分定性定量分析的报道比较多,大体可以分为两大类,即挥发性成分的分析和木脂素成分的分析。挥发性成分的分析大多是先用水蒸气蒸馏(SD)方法提取(所需时间长达数小时),然后用GC-MS联用技术分离鉴定;木脂素成分的分析大多采用TLC法鉴定,或用HPLC法定量分析。而同时分析其挥发性成分和木脂素成分的研究未见文献报道。本文采用微波辅助萃取(MAE)技术一次性同时提取了南五味子和北五味子果实中的挥发性成分和木脂素成分,并用GC-MS联用技术对萃取液进行了分析鉴定。该方法具有高效、快速,操作简便,能耗低,节省溶剂等优点。1紫外仪器和仪器Agilent6890/5975A型GC-MS联用仪(美国惠普公司);NIST05a质谱数据库,Wiley7n质谱数据库;GC-2010气相色谱仪(日本岛津公司),配FID检测器;LC-10A高效液相色谱仪(日本岛津公司),SPD-10ATVP双泵单元,SPD-10ATVP紫外检测器;FZ102微型植物试样粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司);MARS-5型微波消解仪(美国CEM公司);正己烷(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);甲醇(分析纯,天津市博迪化工有限公司)。对照品五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素均购自中国药品生物制品检定所,批号依次为110857-200507,110764-200408,110765-200508。对照药材南五味子和北五味子购自中国药品生物制品检定所,批号分别为121118-200502和120922-200505;分别产自辽宁、黑龙江、湖南的北五味子及产自陕西、湖北、广西的南五味子购自药材市场,产地信息由药材供应商提供,均由湖南师范大学生命科学院李建中教授鉴定。南五味子和北五味子药材用微型植物试样粉碎机粉碎后过0.9mm孔径筛。2测试方法2.1微波辐射冷却称取粉碎后的南五味子和北五味子果实各0.5g,分别置于微波消解仪的熔样罐中,加入正己烷5mL,加压密封后,调微波功率300W,微波辐射90s,冷却后取出,转移至50mL量瓶中,用正己烷定容至刻度,混匀。取上层清液过0.45μm滤膜,取续滤液进样分析。若用于HPLC分析,可准确量取一定体积的续滤液,在水浴上用N2流吹干,再用甲醇定容至原来体积,混匀后进样。2.2萃取产率的比较为了检验MAE方法的萃取效率,以超声波萃取(UE)方法作为参照方法,将2种方法的萃取产率进行比较。称取五味子粉碎样品0.5g于50mL量瓶中,加入甲醇约40mL,室温下超声(功率250W,频率20kHz)40min,取出冷却后加甲醇定容至刻度,混匀,过滤,取续滤液注入HPLC仪分析。2.3柱温升温程序GC-MS用于同时比较分析不同产地的北五味子和南五味子微波萃取液中的挥发性成分和木脂素成分。优化的色谱条件如下:采用HP-5MS毛细管柱(30.0m×0.25mm,0.25μm);进样口温度为280℃,分流比20∶1;载气(He),1mL·min-1;柱温升温程序:初始温度为50℃,保持2min,以5℃·min-1升至180℃,再以30℃·min-1升至240℃,保持10min后,以5℃·min-1升至260℃,10℃·min-1升至终温280℃,保持20min;进样量为1μL。HP5975A质谱检测器(MSD),离子源:EI源,电子能量70eV,电子倍增器电压1164.7V,扫描范围35~600amu,四极杆温度150℃,离子源温度230℃,界面温度280℃,溶剂延迟时间:4min。2.4柱温度和升温程序GC-FID分析用于优化微波萃取参数及3种木脂素成分(五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素)的定量分析。优化的色谱条件如下:色谱柱为HP-5MS毛细管柱(30.0m×0.25mm,0.25μm);进样口温度为280℃,分流比10∶1;载气(N2),0.8mL·min-1;柱温升温程序:初始温度为200℃,保持1min;以2℃·min-1升温至280℃,保持10min;检测器(FID):300℃;H2流量:47mL·min-1,空气流量:400mL·min-1,尾吹:N2,30mL·min-1;进样量为1μL。2.5流动相及紫外检出系统HPLC分析用于与GC方法比较,以说明GC方法用于分析五味子中木脂素成分的可行性。优化的色谱条件如下:色谱柱为SpherigelC18(200mm×4.6mm,5μm);流动相为乙腈-水,梯度洗脱(0~7min,乙腈-水比例保持恒定为60∶40;7~40min,乙腈-水的比例线性变为70∶30;再在1min内线性降低至60∶40,并保持恒定5min后进下一个样品),流速为1mL·min-1;紫外检测波长为254nm;进样量为10μL。3结果与讨论3.1药代动力学测定a区总峰面积a区的含量按“2.3”项所述的色谱条件,以GC-MS法对南五味子和北五味子对照药材微波辅助萃取液进行分离,得到它们的总离子流图(见图1)。各成分的定性依据NIST05a和Wiley7n2个质谱数据库的检索结果,结合人工谱图解析和标准对照品在相同色谱条件下的保留时间及相关文献资料完成。为便于比较2种五味子果实的化学成分,将总离子流图分成3个区:a区(保留时间为4.0~29.8min),b区(保留时间为29.8~38.0min)和c区(保留时间为38.0~65.0min)。定性结果显示a区和b区为挥发性成分部分,a区主要是单萜类和倍半萜类化合物及它们的含氧衍生物;b区主要是脂肪酸及其酯类,包括棕榈酸、亚油酸、亚油酸甲酯、亚油酸乙酯等;c区主要是木脂素类成分。从图1可以看出,南五味子和北五味子对照药材的a区都很复杂,但可以直接从谱图中看出两者的化学成分存在明显差异。以a区总峰面积为1,用峰面积归一化法对a区各组分进行定量,计算各组分的相对百分含量,结果见表1。表1的数据显示,2种五味子的a区都是主要由单萜类和倍半萜类化合物以及它们的含氧衍生物组成。南五味子中单萜类化合物及其衍生物较少,仅3种,且相对百分含量之和较低,约占a区总峰面积的0.50%;而北五味子则有9种,且相对百分含量较高,约占a区总峰面积的6.6%(见图2),后者是前者的10倍以上,这是2种五味子挥发性成分组成的一个明显差别。从2种五味子的a区一共鉴定出78种化学成分,其中共有成分为18种,除花侧柏烯(cuparene)和β-雪松烯(β-himachalene)为两者所共有且相对百分含量均较大(分别为6.56%,7.43%;2.36%,2.54%)外,其他成分及相对百分含量差异很大。2种五味子的总离子流图的b区基本相似,质谱检索结果显示基本相同的化学成分,主要为脂肪酸及其低级酯。c区是2种五味子化学成分对照鲜明的区域(见图3)。从图3中可见,北五味子和南五味子对照药材木脂素成分存在明显差异,北五味子萃取液中峰面积较大的峰为3号、5号、7号峰,而南五味子萃取液峰面积较大的峰为1号和2号峰。两者共有的峰仅1号、2号、9号和10号4个峰,且除9号峰外,其他各峰峰面积相差悬殊。根据五味子甲素、五味子乙素和五味子醇甲的对照品溶液(将五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素对照品溶于甲醇,配制成浓度分别为0.03776,0.06608,0.05704g·L-1的混合溶液)在相同色谱条件下进样分析所得到的保留时间和质谱图,可以确定2号峰为五味子甲素,3号峰为五味子乙素,5号峰为五味子醇甲。再根据总离子流图中其他各峰的质谱图,借助质谱库中的标准谱图和相关文献资料,可以确定6号峰为五味子丙素,7号峰为五味子醇乙,9号峰为五味子酯乙,10号峰为五味子酯丙。4号峰与3号峰的质谱图很相似,通过改变柱温程序发现这2个峰很难完全分离,结合文献,推测可能是五味子乙素的异构体戈米辛(gomisinN)。1号峰的质谱图与谱库中6-澳白木脂素(austrobailignan6)的标准谱图比较相似,谱图匹配率为80%,是否为6-澳白木脂素有待于进一步确定。其他各峰受现有条件限制,尚不能定性。综上所述,南五味子和北五味子都含有挥发性成分(萜类、脂肪酸及其衍生物)和木脂素成分,但它们的挥发性成分和木脂素成分的具体组成及其相对百分含量却存在很大的差异;南五味子中含有较高含量的五味子甲素,几乎不含五味子醇甲、五味子醇乙和五味子乙素等木脂素成分,而北五味子中含有较高含量的五味子醇甲、五味子醇乙和五味子乙素等,五味子甲素的含量则相对不高。这可能是南、北五味子既具有相似的药理功效,又在品质上存在差异的根本原因。3.2mae条件优化3.2.1萃取溶剂的选择本实验曾尝试使用乙酸乙酯、丙酮、乙醚、二氯甲烷、乙醇、甲醇和正己烷7种溶剂做为萃取剂,在其他条件一致的情况下(微波功率300W,辐射1min)提取并分析了辽宁产北五味子果实中的化学成分,根据萃取液中各组分峰的峰面积考察溶剂的优劣。结果显示,各种溶剂萃取液的组分峰面积差别不明显,正己烷和二氯甲烷萃取液各组分峰面积相对较大;极性较强的溶剂(甲醇、乙醇、丙酮)比极性较弱的溶剂(正己烷、乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷)的萃取液的色谱峰数目略多,但五味子醇甲、五味子醇乙的峰面积明显偏小,而其他主要峰的峰面积相差不大,原因尚不清楚。因二氯甲烷的毒性较大,且正己烷萃取液的挥发性成分部分与采用传统的SD方法得到的挥发性成分的GC-FID色谱图很相似(见图4),故本实验最终选择正己烷作为萃取溶剂。3.2.2萃取时间的选择以正己烷为萃取溶剂,微波功率设置为300W,分别对辽宁产五味子萃取30,60,90,120s,所得萃取液中各组分的峰面积以萃取90s和120s最大,故本实验选择90s的萃取时间。3.3种萃取方法所提取木脂素的含量为了考察MAE方法的萃取效果,将MAE方法和UE方法进行对比,用HPLC法(色谱条件见“2.5”项)分析了2种方法处理的辽宁五味子萃取液中的五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素3种木脂素成分的含量,并进行了显著性分析,结果显示,2种萃取方法所得到的五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素含量接近,且t值均小于t0.05,10(2.23),说明2种萃取方法之间不存在显著性差异,但MAE方法将样品处理时间从40min缩短到90s。3.4色谱分析结果五味子中木脂素成分含量的分析方法大多采用HPLC法。我们尝试用GC-FID方法定量分析了辽宁产五味子中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素3种木脂素成分的含量,色谱条件见“2.4”项。结果发现:各木脂素成分色谱峰能较好地分离;GC-FID方法测得的上述3种木脂素成分的含量分别为0.898%,0.104%,0.253%,与HPLC方法测得的结果(分别为0.900%,0.101%,0.250%)相符,说明GC分析数据可靠。3.5南药萃取-gc-ms分析以正己烷为萃取溶剂,微波辐射功率为300W,辐射时间为90s,萃取了辽宁、黑龙江和湖南3个产地的北五味子,陕西、广西和湖北3个产地的南五味子以及2个未知产地的北五味子和南五味子果实中的化学成分,将萃取液在前述色谱条件(“2.3”项)下进样分析,得到的GC-MS谱图见图5。从图5中可以明显看出,不同产地的北五味子和南五味子(包括2个未知产地的)的微波辅助溶剂萃取液的GC-MS图谱都与各自的对照药材相似。4gc-ms联用技术本文采用MAE技术在密闭容器内一