树突状细胞介导的抗寄生虫感染免疫反应中的不良反应

树突状细胞介导的抗寄生虫感染免疫反应中的不良反应

***树突状细胞（cd）是具有最强机械功能的独特抗炎细胞（apc），可以显著激活初始t细胞，并成为身体免疫反应的先驱。大量研究表明,DC在抗肿瘤、抗感染及移植排斥和自身免疫疾病中发挥重要作用。寄生虫感染后一方面影响DC的成熟,诱导机体产生抵抗寄生虫的免疫反应,另一方面影响DC的正常功能,有助于寄生虫完成免疫逃避。前期研究发现,细粒棘球蚴重组抗原Eg.ferritin具有较好的反应原性及免疫原性,能够刺激DC的发育。研究发现,阻断Notch信号通路会影响DC的发育。Notch信号通路作为一个进化高度保守的信号转导系统,广泛表达于多个物种,可通过调节免疫细胞的发育和功能来调节机体的免疫功能,包括T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞、DC等免疫细胞。但Notch信号通路在Eg.ferritin影响DC发育过程中的作用机制尚不清楚。本研究利用γ-分泌酶抑制剂DAPT处理DC,阻断细胞的Notch信号通路,探索Notch信号通路是否参与DC介导的抗寄生虫感染免疫反应。材料和方法1材料表面1.1实验动物1.2试验用产品和试剂RPMI1640细胞培养液购于美国Gibco公司;胎牛血清购于美国HyClone公司;rmGM-CSF、rmIL-4购于美国R&D公司;PE-antimouseCD11c、PE-Cyanin5-anti-mouseCD40、PE-Cyanin5-anti-mouseMHCⅡ和FITC-anti-mouseCD80、FITC-anti-mouseCD86购于美国eBioscience公司;DAPT和LPS购于美国Sigma公司;Trizol、反转录试剂盒购于德国Roche公司;Eg.ferritin为本实验室制备。1.3荧光定量pcr和药物培养方法倒置光学显微镜购于日本Olympus公司;流式细胞仪购于美国Millipore公司;扫描式电子显微镜购于日本Hitachi公司;荧光定量PCR仪购于美国Bio-Rad公司;恒温细胞培养箱购于美国Thermo公司;细胞培养板购于美国Corning公司。2方法2.1骨髓最佳内标物的制备取两只4~6周龄C57BL/6雄鼠,颈椎处死,酒精浸泡5~10min,于超净台内取股骨,PBS冲洗2遍;用1640将骨髓冲出,以240g离心10min,弃上清;加红细胞裂解液,静止4min,离心,1640洗2遍,计数,用10%FBS培养液(含1%双抗、2mmol/L谷氨酰胺、50μmol/Lβ-巯基乙醇、20ng/mlGM-CSF、10ng/mlIL-4)调整细胞浓度为2×106个/ml,接种于24孔板,放入37℃、5%CO2培养箱中培养。2.2dapt、lps联合多态性原则抗原刺激DC培养第7d时,收集细胞,重悬于不含GM-CSF和IL-4的培养基中。调整细胞浓度为1×106个/ml,接种于24孔板,提前加入DAPT进行处理或不进行处理,然后分组加入Eg.ferritin(1μg/ml)、LPS(100ng/ml),刺激20h。DMSO组加入DMSO作为对照组。2.4.1扫描电子显微镜2.5统计分析所有数据均以均数±标准差(ue0af±s)表示,多组间比较采用方差分析(ANOVA检验),P<0.05有差异统计学意义。结果1dapt处理细胞的计数结果小鼠骨髓细胞在含有GM-CSF和IL-4的RP-MI1640完全培养液中培养,诱导产生大量未成熟DCs。在诱导过程中,加入不同浓度的DAPT处理细胞,用倒置显微镜观察,结果见图1。与DMSO组相比,10μmol/LDAPT处理组出现少量的细胞集落,细胞数量减少;50μmol/LDAPT处理组细胞散在分布,细胞数量减少;100μmol/LDAPT处理组未见克隆团,细胞数量减少并出现大量不明结晶状物质,可能是DAPT浓度过饱和而形成。细胞计数结果见表1,细胞数量随DAPT浓度的增高而减少。2dapt对dc细胞培养中etp的表达应用Q-PCR技术检测经不同浓度DAPT在不同时间段处理的DC细胞Notch1mRNA表达水平。结果显示,DAPT处理后能够降低DC细胞Notch1mR-NA的表达水平,以在第0d时用DAPT处理的DC细胞,Notch1mRNA表达水平降低最显著,且以50μmol/LDAPT处理组水平最低。在第7d用DAPT处理的DC细胞Notch1mRNA的表达水平降低不明显(图2)。3树突细胞dc加入抗原刺激20h后,在扫描电镜下观察各组DC的形态,并计数100个细胞(图3A)。细胞表面较光滑,很少或无树突状突起的为未成熟DC。细胞表面粗糙,有大量褶皱,并且出现长短不一的大量树突状突起为成熟DC(图3B,3C)。Eg.ferritin组与LPS组中出现树突的细胞数量多于DMSO组;DAPT处理后,Eg.ferritin组与LPS组树突状DC细胞占总细胞量的比例显著降低,树突数量减少,差异均有统计学意义(F=34.12,P<0.05)。4结果图1收集经Eg.ferritin刺激20h的DC细胞,通过流式细胞仪检测细胞表面分子的表达水平,以LPS作为阳性对照,结果见图4。与1640对照组相比,Eg.ferritin、LPS组均能上调CD80(F=19.49)、CD86(F=36.21)、MHCII(F=26.73)、CD40(F=29.71)的表达,差异有统计学意义(P<0.05),且Eg.ferritin组上调CD80、CD86、MHCII、CD40表达的能力高于LPS组。5流式细胞仪检测细胞表面分子表达水平为明确Notch信号通路是否影响重组抗原刺激DC的分化成熟,利用DAPT处理DC,阻断细胞的Notch信号通路,第7d时加入抗原刺激20h,通过流式细胞仪检测细胞表面分子的表达水平,结果见图5。Eg.ferritin+DAPT、LPS+DAPT组与Eg.ferritin、LPS组相比,DAPT处理后DC细胞表面分子的表达水平差异有统计学意义(P<0.05)。etch信号通路动物攻击感染实验证明,Eg.ferritin能够诱导宿主产生85.6%的免疫保护力。用Eg.ferritin免疫新西兰家兔,制备的抗血清对原头蚴也具有明显的杀伤作用。但是Eg.ferritin是如何诱导宿主产生免疫保护力的尚不清楚。抗原进入机体后首先被APC捕获,并进行加工和处理,随后将抗原信息提呈给T细胞,有效地激活初始T细胞,产生免疫应答。DC作为体内激活初始T细胞的最重要APC,既能提供初始T细胞活化的抗原刺激信号,也能提供共刺激信号,启动机体特异性和非特异性免疫应答,处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。因此,当机体受到寄生虫感染时,DC在机体抵抗感染及启动免疫应答过程中起重要作用。Notch信号通路由Notch受体蛋白、Notch配体蛋白和CSL(DNA结合蛋白)三部分组成。Notch受体在各种细胞表面都有分布,能通过与配体的相互作用转导细胞信号,从而在细胞增殖、分化、凋亡中发挥重要的调控作用。当受体与配体结合后,Notch受体通过释放其胞内区(Notchintracellulardomain,NICD)进入细胞核,激活CSL介导的Notch信号通路。Notch1是该信号通路的重要受体,其表达与否可间接反映Notch信号的强弱及是否激活。研究发现,Notch与肿瘤细胞的异常调控相关,能够调控多种肿瘤细胞的生长、分化、增殖和凋亡。Feng等报道上调或下调Notch信号能够影响DC的抗肿瘤免疫反应。那么Notch信号通路在DC抗寄生虫感染过程中发挥怎样的作用呢?γ-分泌酶是Notch活化形成NICD过程中的关键剪切酶,γ-分泌酶抑制剂DAPT能够特异性抑制γ-分泌酶的活性,阻断Notch胞内段NICD的释放。本实验用不同浓度DAPT在不同时间段处理DC,结果显示加入DAPT后细胞存活能力降低,细胞数目减少,且与DAPT浓度呈负相关。另外,在细胞培养开始就用DAPT处理,各个浓度的DAPT均能有效降低Notch1的表达,以50μmol/LDAPT组降低最显著,而在第7d时用DAPT处理的DC细胞Notch1mR-NA表达水平降低不明显。说明50μmol/LDAPT能够有效阻断DC的Notch信号通路。为了进一步探索Notch信号如何参与DC介导的抗寄生虫感染免疫反应,本实验通过Eg.ferritin与Notch信号缺失的DC进行共同培养,观察DC的形态变化并检测DC表面分子的表达水平。DC先是通过吞噬作用或受体介导的内吞作用摄取抗原,随后MHCⅡ类分子通过抗原肽与T细胞表面的TCR相结合,提供活化T细胞的第一信号;CD80/CD86是DC活化T细胞的共刺激信号,与T细胞表面的CD28结合,做为T细胞活化的第二信号;粘附分子CD40与T细胞表面的CD40L结合,也是活化T细胞的重要信号。结果显示,Eg.ferritin能够促进DC发育成熟,主要表现为刺激细胞表面树突的生成,上调DC表面分子的表达。Eg.ferritin刺激后的DC高表达MHCII类分子、CD80、CD86及CD40,说明Eg.ferritin能够通过促进DC的成熟,继而大量活化T细胞,诱导机体的免疫应答。本实验通过利用DAPT阻断DC的Notch信号通路后,加入Eg.ferritin作用于DC,与DAPT未处理组相比,Notch信号缺失的DC表达低水平的表面分子,呈现不成熟的细胞形态,说明Notch信号通路的阻断能有效抑制Eg.ferritin促进DC向成熟形态分化的能力,未成熟DC的增多则可能诱导机体产生免疫耐受。Notch信号通路不仅能够影响DC的发育成熟,而且涉及Eg.ferritin诱导机体产生免疫保护力的过程。上调Notch信号,是否能相应地增强DC对重组抗原产生的免疫应答,是否能更有效地抵抗寄生虫的感染还有待进一步研究。6~8周龄C57BL/6雄鼠,由宁夏医科大学实验动物中心提供。将制备的DC分为两组,一组在DC培养第0d时每孔依次加入DAPT(终浓度分别为10、50、100μmol/L)及DMSO,分别于第3d和第5d半量换液时,补足DAPT及DMSO,培养至第7d时,收集细胞;另一组在第3d和第5d进行半量换液,培养第7d时收集细胞,调整细胞浓度为1×106个/ml,接种于24孔板,每孔依次加入DAPT(终浓度分别为10、50、100μmol/L)及DMSO,处理2h。2.3-actin—Q-PCR检测DAPT处理DC细胞中Notch1mRNA的表达水平采用Trizol法提取DC细胞的RNA,然后逆转录为cDNA。Notch1上游引物:5′-CAGCTTGCACAACCAGACAGAC-3′;下游引物:5′-ACGGAGTACGGCCCATGTT-3′。以β-actin为内参。β-actin上游引物:5′-CCAGTTGGTAA-CAATGCCATGT-3′;下游引物:5′-TATTTC-CCCAACACGCTCGG-3′。上机进行Q-PCR反应。2.4dc构建片在24孔板中事先放入玻璃爬片,使DAPT处理后的DC可以附着在玻片上生长,制成DC爬片。加入重组抗原刺激20h后,将爬片取出并于3%新鲜戊二醛中4℃固定过夜,