实验52 高效毛细管电泳电导检测法分离检测水中阴离子

实验名称：高效毛细管电泳/电导检测法

测定饮用水中阴离子

实验学时：5

实验类型：基础性实验主讲教师：谢天尧副教授♦引言♦毛细管电泳根本理论♦毛细管电泳中的电渗流♦参数与关系式♦进样方式♦检测器及数据工作站♦毛细管电泳仪结构♦应用例如♦实验目的♦实验内容♦预习要求内容在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现别离。引言1937年，蒂塞利乌斯〔Tiselius，瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液别离出白蛋白和α、β、γ球蛋白；1948年，获诺贝尔化学奖。利用电泳现象对某些化学或生物物质进行别离分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术。按形状分类：U型管电泳、柱状电泳、板电泳；按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、自由电泳；传统电泳分析：操作烦琐，别离效率低，定量困难，无法与其他分析相比。1981年，Jorgenson和Luckas，用75m内径石英毛细管进行电泳分析，柱效高达40万/m，促进电泳技术发生了根本变革，迅速开展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的别离分析技术——高效毛细管电泳〔highperformancecapillaryelectrophoresis，HPCE〕。高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：一是采用了50微米〔mm)内径的毛细管,；二是采用了高达万伏的别离电压。毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加，高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以到达数百万。高效毛细管电泳分析的特点1.仪器简单、易自动化电源、毛细管、检测器、溶液瓶2.分析速度快、别离效率高在3.1min内别离36种无机及有机阴离子，4.1min内别离了24种阳离子；别离柱效：105～107/m理论塔板数；3.操作方便、消耗少进样量极少，水介质中进行；4.应用范围极广有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等；分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等；高效毛细管电泳(HPCE)根本理论

basicprinciplesofHPCE

电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有不同的迁移速度，迁移速度与哪些因素有关？

当带电离子以速度ν在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。电场力：FE=qE

阻力：F=fν故：qE=fνq—离子所带的有效电荷；E—电场强度；ν—离子在电场中的迁移速度；f—平动摩擦系数(对于球形离子：

f=6πηγ；γ

—离子的表观液态动力学半径；η—介质的粘度；)所以，迁移速度：或物质离子在电场中差速迁移是电泳别离的根底。淌度μ：单位电场强度下的平均电泳速度。毛细管电泳中的电渗流

electroosmoticflow，EOF1.HPCE中的电渗流现象当固体与液体接触时，固体外表由于某种原因带一种电荷，那么因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双电层。当充满液体的毛细管两端施加电压时，就会发生管中液体相对于毛细管管壁外表作整体移动的现象，称之为电渗流〔electroosmoticflow，简称EOF〕。2.电渗流形成的原因石英毛细管柱，内充液pH>3时，外表电离成-SiO-,管内壁带负电荷，与溶液离子间形成双电层。在高压电场的作用下，带正电荷的溶液外表及扩散层向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，速度ν电渗流。3.电渗流的大小与方向电渗流的大小用电渗流速度ν电渗流表示，取决于电渗淌度μ和电场强度E。即ν电渗流=μE电渗淌度取决于电泳介质及双电层的Zeta电势，即μ=ε0εξε0—真空介电常数；ε—介电常数；ξ—毛细管壁的Zeta电势。ν电渗流=ε0εξE实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算ν电渗流=Lef/teoLef—毛细管有效长度；teo—电渗流标记物〔中性物质〕的迁移时间。孔隙率与孔径：电渗流的方向取决于毛细管内外表电荷的性质：内外表带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；内外表带正电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极；石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；改变电渗流方向的方法：〔1〕毛细管改性外表键合阳离子基团；〔2〕加电渗流反转剂内充液中参加大量的阳离子外表活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液外表带负电荷。电渗流流向阳极。4.电渗流的流型电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式流动〔谱带展宽很小〕；液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍〔引起谱带展宽较大〕。5.HPCE中电渗流的作用电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的5～7倍；各种带电离子在毛细管柱中的迁移速度为：ν+=ν电渗流+ν+ef阳离子运动方向与电渗流一致；ν-=ν电渗流-ν-ef阴离子运动方向与电渗流相反；ν0=ν电渗流中性粒子运动方向与电渗流一致；〔1〕可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的别离；〔2〕改变电渗流的大小和方向可改变别离效率和选择性，如同改变LC中的流速；〔3〕电渗流的微小变化影响结果的重现性；在HPCE中，控制电渗流非常重要。6.影响电渗流的因素〔1〕电场强度的影响电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。〔2〕毛细管材料的影响不同材料毛细管的外表电荷特性不同，产生的电渗流大小不同；〔3〕电泳运行液的影响溶液pH的影响对于石英毛细管，溶液pH增高时，外表电离多，电荷密度增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大；pH<3，完全被氢离子中和，外表几乎呈中性，电渗流接近零。分析时，采用缓冲溶液来保持pH稳定。阴离子的影响在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中的电流有较大差异，产生的焦耳热不同。缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液黏度和工作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液离子强度增加，电渗流下降。〔4〕温度的影响毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。温度变化来自于“焦耳热〞；焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量；HPCE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强度成正比。温度每变化1℃，将引起背景电解质溶液黏度变化2%～3%；1、参加浓度较大的中性盐，溶液离子强度增大，使溶液的黏度增大，电渗流减小。2、参加外表活性剂，可改变电渗流的大小和方向；参加不同阳离子外表活性剂来控制电渗流。参加阴离子外表活性剂，如十二烷基硫酸钠〔SDS〕，可以使壁外表负电荷增加，zeta电势增大，电渗流增大；3、参加有机溶剂如甲醇、乙腈，使电渗流增大。〔5〕添加剂的影响

HPCE中的主要参数与关系式淌度：带电离子在单位电场下的迁移速度；淌度不同是电泳别离的根底。1.绝对淌度(absolutemobility)μab无限稀释溶液中带电离子在单位电场强度下的平均迁移速度，简称淌度。可在手册中查阅。2.有效淌度(effectivemobility)μef实际溶液中的淌度(实验中测定的)。μef=∑aiμiai—溶质i的解离度；μi—溶质i在解离状态下的绝对淌度3.表观淌度μap离子在实际别离过程中的迁移速度〔表观迁移速度〕：νap=μapE1.迁移时间〔保存时间〕HPCE兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。有关色谱理论也适用。V—外加电压；L—毛细管总长度；2.别离效率〔塔板数〕在HPCE中，仅存在纵向扩散，σ2=2Dt扩散系数小的溶质比扩散系数大的别离效率高，别离生物大分子的依据。3.别离度D－扩散系数；Lef－毛细管有效长；L－毛细管全长度；V－工作电压；Δμ－二者之差。影响别离度的主要因素；工作电压V；毛细管有效长度与总长度比；有效淌度差。别离度可按谱图直接由下式计算：图13-23吸附等温线的类型图13-23吸附等温线的类型4.焦耳热

电泳过程产生的焦耳热可由下式计算：m—电解质溶液的摩尔电导；I—工作电流：cm—电解质浓度；散热过程中，在毛细管内形成温度梯度〔中心温度高〕，破坏了塞流，导致区带展宽。改善方法：〔1〕减小毛细管内径；〔2〕控制散热；

HPCE中的进样方式进样量：毛细管长度的1%-2%；纳升级、非常小；1.流体力学进样方式〔1〕进样端加压力〔一般为气压〕〔2〕出口端抽真空〔3〕虹吸进样2.电动进样方式毛细管两端加一个适宜的电压，样品中离子的组分通过电迁移进入毛细管中。特点：进样不均：电歧视现象，淌度大的离子比淌度大的进样量大；离子丧失：淌度大且与电渗流方向相反的离子可能进不去；特别适合黏度大的试样。可以通过电堆积效应提高灵敏度。3.扩散进样方式

样品中的组分通过扩散作用进入毛细管中。4.电渗流进样方式样品中的组分〔特别是中性组分〕通过电渗流的作用进入毛细管中，是电动进样的延伸。5.注射器进样方式

采用特殊装置，通过注射器使样品组分进入毛细管中。HPCE的别离模式1.自由区带模式〔CZE)带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；阴离子：两种效应的运动方向相反；ν电渗流>ν电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类别离,同种类离子由于差速迁移被相互别离。最根本、应用广的别离模式；2.毛细管凝胶电泳〔CGE)将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小别离。能够有效减小组分扩散，所得峰型锋利，别离效率高。蛋白质、DNA等的电荷/质量比与分子大小无关，CZE模式很难别离，采用CGE能获得良好别离，DAN排序的重要手段。特点：抗对流性好，散热性好，别离度极高。无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱廉价、易制备。3.胶束电动毛细管色谱〔MECC，MEKC〕缓冲溶液中参加离子型外表活性剂，其浓度到达临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。在电场力的作用下，胶束在柱中移动。中性分子在胶束相和溶液〔水相〕间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；可用来别离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围；1.根据等电点差异别离生物大分子的高分辨率电泳技术；2.毛细管内充有两性电解质〔合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物〕，当施加直流电压〔6～8V〕时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度；3.氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液pH有关，在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，淌度为零；4.聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到达满足其等电点pH的位置时，呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互别离；5.阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀NaOH溶液；6.加压将毛细管内别离后的溶液推出经过检测器检测；7.电渗流在CIEF中不利，应消除或减小。4.毛细管等电聚焦〔CIEF〕

5.毛细管等速电泳〔CITP〕1.将两种淌度差异很大的缓冲液分别作为前导离子(充满毛细管)和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间，并以同一速度移动。2.负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负离子的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐渐形成各自独立的区带而别离。阴极进样，阳极检测。3.不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同(ν=μE)，淌度大的离子区带电场强度小；沿出口到进口，将不同区带依次排序1、2、3、4电场强度依次增大。假设“2〞号中离子扩散到“3〞号，该区电场强度大，离子被加速，返回到“2〞区；当“2〞号中离子跑到“1〞号区，离子被减速使之归队；4.特点：界面明显，富集、浓缩作用；6.毛细管电色谱〔CEC〕在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，以电渗流为流动相，试样组分在两相间的分配为别离机理的电动色谱过程；

HPCE的检测器检测器检测限(mol/L)特点UV－可见吸收10－4～10－5近似通用，常规应用激光光热10-7～10-8灵敏度高，受激光器波长限制荧光非相干光诱导激光诱导10-7～10-810-10～10-11灵敏度高高灵敏度，价格昂贵折射指数10-6～10-7通用性强，结构简单，灵敏度较低电位电导安培10-5～10-710-5～10-810-8～10-10通用性，灵敏度高，价格适中。灵敏度高，要求有电活性。质谱10-7～10-9仪器复杂，可获得结构信息，质量灵敏度高放射10-8～10-11灵敏度高，操作放射性物质有特殊要求间接法间接UV间接LIF10-4～10-510-8～10-8通用性强，灵敏度比直接法低1－2个数量级

高效毛细管电泳仪

highperformancecapillaryelectrophoresisapparatus

HPCE的仪器系统1.仪器主要部件高压电源：0～30kV；毛细管别离柱紫外、激光诱导荧光、电导、安培检测器等。毛细管数据工作站1.高压电源〔1〕0～30kV稳定、连续可调的直流电源；〔2〕具有恒压、恒流、恒功率输出；〔3〕电场强度程序控制系统；〔4〕电压稳定性：0.1%；〔5〕电源极性易转换；2.毛细管柱〔1〕材料：石英：各项性能好；玻璃：光学、机械性能差；〔2〕规格：内径20～75μm，外径350～400μm；长度<=1m毛细管是CE别离的心脏。理想的毛细管必须是电绝缘、紫外/可见光透明且富有弹性的，目前可以使用的有玻璃、熔融石英或聚四氟乙烯塑料等。毛细管内径一般为10～100μm，其截面结构图标意图如图17.23所示。紫外检测器的核心部件电导检测器的核心部件毛细管电泳数据工作站教学型CES2003毛细管电泳仪实物图高压电源进样端检测池电导检测器数据工作站HPCE应用例如一、离子分析

analysisofion阳离子分析迁移方向和电渗流方向一致；4.5min内别离了24种金属离子；阳极进样，阴极检测；具有很高的灵敏度；阴离子分析阴离子电泳方向和电渗流方向相反、速度接近，分析时间长、效率低；质量小、电荷密度大的离子如：SO4-2、Cl-、F-等，电泳速率大于电渗流，阳极端流出，在阴极端无法检测；参加电渗流改性剂，十六烷基三甲基溴化胺等，使电泳方向和电渗流方向一致，可在3.1min内别离36种阴离子；阴极进样，阳极检测；离子价态及存在形态分析；二、药物分析

analysisofpharmaceutics检测体液或细胞中某些代谢产物的分析；尿液中的氨基酸含量作为临床诊断糖尿病的辅助手段；采用毛细管区带电泳方式，在11min内别离17种药物；采用MEKC模式，鉴定违禁药物；效果优于HPLC法三、手性化合物分析

analysisofchiralcompounds合成获得单一手性化合物相当困难；528种手性合成药物，61中以单一对映体形式销售，其他为外消旋体；检测分析也相当困难；研究热点；R-反响停是安眠药，S-式致胎儿畸形；HPCE别离分析手性化合物的方法：参加手性选择剂；形成配合物的稳定常数有差异，结合HPCE的高效率；常用手性选择剂：环糊精及其衍生物；手性冠醚；手性外表活性剂〔氨基酸衍生物、胆酸钠、牛磺脱氧胆酸及其钠盐、低聚糖等天然手性外表活性剂〕四、氨基酸与蛋白质分析

analysisofaminoacids采用MEKC模式，在25分钟内别离了23种丹酰化氨基酸；HPCE可取代传统的氨基酸分析仪；问题：吸附和检测；五、核酸分析及DNA排序

analysisofnucleicacidsandsequence

ofDNA重要分析手段；右图：酶解的双螺旋DNA限制性片段的别离；

●学习高效毛细管电泳仪〔HPCE〕的操作使用。●熟悉高效毛细管电泳法分析的根本原理和实验方法。●掌握饮用水中Cl-、NO3-、SO42-的毛细管电泳别离/电导检测的测定原理和技术。实验目的实验内容本实验采用四乙烯五胺作为毛细管电泳的电渗流抑制剂，以10mm