微生物的实验室培养

微生物特点：结构都相当简单,个体多数十分微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.且体内一般不含有叶绿素.不能进行光合作用.

原核生物界

原生生物界真菌界病毒界(细菌、放线菌、蓝藻)(酵母菌霉菌大型真菌)(草履虫变形虫衣藻)(噬菌体、艾滋病毒)约有10万种细菌的外形与大小细菌：单细胞不分枝的原核微生物。细菌细胞微小而透明，通常用适当染料染色后显微镜观察图1-1常见的三种细菌典型形态A.球菌B.杆菌C.螺旋菌细菌细胞由外向里依次有鞭毛、菌〔纤〕毛、荚膜、细胞壁、细胞膜、细胞质，细胞质中又有液泡、储存性颗粒、核质等。细菌的构造

图1-3细菌的结构*细胞壁结构特点：坚韧且有弹性细胞壁有哪些功能？①固定细胞外形；

②保护细胞免受外力的损伤；

③阻拦大分子物质进人细胞；

④使细胞具有致病性及对噬菌体的敏感性。伤寒杆菌细胞壁中含毒素芽孢有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜〔如温度、水分适宜〕的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌单个或者少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。每种细菌在一定条件下所形成的菌落，可以作为菌种鉴定的重要依据。特征：大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等。功能：定义：无鞭毛的球菌，常形成较小较厚边缘较整齐的菌落，有鞭毛细菌形成大而扁平、边缘波浪或锯齿状菌落细菌的菌落形态各异的菌落放线菌1、结构：单细胞原核分支状的菌丝〔基内菌丝、气生菌丝〕2、繁殖孢子丝——孢子链霉素、土霉素、四环素、氯霉素、红霉素、庆大霉素

微生物中发现了几千种抗生素，其中2/3是由放线菌产生的

应用:病毒

SARS病毒、禽流感病毒、朊病毒〔蛋白质病毒〕1、病毒的结构〔1〕、衣壳〔2〕、核酸核衣壳2、病毒的增殖：真菌如图是酵母菌电子显微镜下的形态结构酵母菌和霉菌青霉专题2微生物的培养与应用课题1微生物的实验室培养(二)培养基1.分类(按物理形态分)(1)液体培养基(2)固体培养基常用的固体培养基:琼脂固体培养基.②微生物在固体培养基外表生长,可以形成肉眼可见的菌落.2.培养基内所含的根本物质(1)水(2)碳源(3)氮源(4)无机盐(2)碳源可作为碳源的物质有:含碳无机物:、、含碳有机物：蛋白质脂肪酸返回不同微生物所利用的碳源不同异养型微生物的碳源为自养型微生物的碳源为碳酸盐碳酸氢盐二氧化碳糖类〔主要〕含碳有机物〔有机碳〕含碳无机物〔无机碳〕(3)氮源可作为氮源的物质有:含氮无机物：、、、含氮有机物：蛋白胨牛肉膏尿素返回固氮微生物所利用的氮源是氮气氨气硝酸盐氨盐氮气练习1〔多项选择〕1、以下细菌中，能利用含碳无机物作碳源的是A光合细菌B根瘤菌C硝化细菌D乳酸菌2、培养大肠杆菌的培养基中，必需含有的碳源和氮源是A糖、有机酸等B二氧化碳、碳酸盐C蛋白质D无机氮化物3、以下表达不正确的选项是A培养基是为微生物的生长繁殖提供营养的基质B液体培养基和固体培养基所含的最根本物质不相同C微生物在固体培养基上生长时，可以形成肉眼可见的单个细菌A.CA.CB.C.(1)pH值如:培养霉菌需酸性、培养细菌需中性或微碱性(2)特殊营养物质----?如：培养乳酸杆菌需要在培养基中添加维生素(3)氧气的含量如:培养厌氧微生物时需要提供无氧的条件3.培养基内所需的其他条件生长因子(三)无菌技术1、获得纯洁培养物的关键:2、无菌技术包括的四大方面(参看教材15页)3、消毒与灭菌(1)消毒：概念：使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体外表或内部一局部对人体有害的微生物。包括芽孢和孢子吗？方法:煮沸消毒法巴氏消毒法:如牛奶的消毒化学药剂消毒:酒精、氯气、石碳酸、煤酚皂溶液等紫外线消毒(不包括芽孢和孢子)防止外来杂菌的入侵〔2〕灭菌概念：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。方法：a

灼烧灭菌b

干热灭菌c

高压蒸汽灭菌灼烧灭菌微生物的接种工具(接种环、接种针)或其他金属用具直接在火焰的充分燃烧层灼烧注意适用范围干热灭菌

160－170℃；1－2h能耐高温的需要保持枯燥的物品(玻璃器皿)高压蒸汽灭菌100kPa121℃15-30min通常用于培养基的灭菌思考:1)无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？2)消毒和灭菌有何不同？3)为什么消毒牛奶要用巴氏消毒法?4)请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择适宜的方法。①培养细菌用的培养基与培养皿②玻棒、试管、烧瓶和吸管③实验操作者的双手消毒灭菌条件温和强烈作用范围物体表面或内部一部分,不包括芽孢和孢子物体内外所有微生物,包括芽孢和孢子无菌技术还能有效防止操作者自身被微生物感染。灭菌灭菌消毒营养成分不被破坏二、实验操作〔一〕制备牛肉膏蛋白胨固体培养基计算－称量－溶化－灭菌－倒平板〔二〕纯化大肠杆菌接种方法有：平板划线法和稀释涂布平板法〔三〕将接种后的培养基和一个未接种的培养基放入37℃恒温箱中培养12h和24h后，观察并记录?思考1溶化时为什么要将牛肉膏连同称量纸一起加热?

答:②加琼脂的目的是什么?答:可保证粘附在称量纸上的牛肉膏也能溶于水中,减少误差作为凝固剂思考2在灭菌前,用牛皮纸、旧报纸包紧盛有培养基的锥形瓶的目的是什么？答:

②培养皿能否用高压蒸汽灭菌？答:?在灭菌时能防止水蒸汽凝结时浸湿棉塞,在取出培养基锥形瓶时也起到隔绝空气中杂菌污染的作用不能,因为培养皿要保持枯燥,应该用干热灭菌.倒平板讨论:(1).培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么方法来估计培养基的温度？(2).为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？(3).平板冷凝后，为什么要将平板倒置？(4).在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？提示：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基外表的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基外表的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。平板划线法(1).为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？(2).在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？(3).在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？讨论:答：操作的第一步灼烧接种环是为了防止接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，防止细菌污染环境和感染操作者。答：以免接种环温度太高，杀死菌种。答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。涂布平板操作讨论:涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？提示：应从操作的各个细节保证“无菌〞。例如，酒精灯与培养皿的距离要适宜、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。结果分析与评价课题延伸问题讨论假设硝化细菌、圆褐固氮菌、不固氮的蓝藻混合在一起，我们配置什么样的培养即可以将三种微生物别离？碳源氮源能源硝化细菌CO2氨氨圆褐固氮菌糖类等含碳有机物N2有机物不固氮的蓝藻CO2铵盐、硝酸盐光选择培养基参加青霉素的培养基:别离酵母菌、霉菌等真菌参加高浓度食盐的培养基:别离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基:别离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基:别离自养型微生物参加青霉素等抗生素的培养基:别离导入了目的基因的受体细胞参加氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养基:别离杂交瘤细胞代谢类型营养类型能源氢的供体基本碳源微生物举例光能无机营养（光能自养型）光无机物二氧化碳蓝细菌绿色硫细菌藻类光能有机营养（光能异养型）光有机物二氧化碳及简单有机物紫色非硫细菌化能无机营养（化能自养型）无机物无机物二氧化碳硝化细菌氢细菌化能有机营养（化能异养型）有机物有机物有机物大多数已知细菌和全部真核微生物讨论1．在高压蒸汽灭菌开始以前，为什么要将灭菌锅内的冷空气排尽？

在高压蒸汽灭菌以前，如果高压蒸汽灭菌锅内的冷空气没有排尽，当压力上升到100kPa时，锅内的温度就不会上升到应有的高度，导致灭菌不彻底。2．灭菌完毕以后，如果压力未降到0就翻开排气阀，会出现什么现象？为什么？如果压力未降到零就翻开排气阀，试管内的培养基就会冲出管口。这是因为高压蒸汽灭菌锅内外压力不平衡的缘故3．接种操作为什么一定要在火焰 旁边进行？空气中存在有大量的微生物，而接种灯的火焰旁能形成一个无菌区域，在这里操作，可以防止杂菌污染练习：1、培养细菌需要根据某种细菌的________________配制特定的________________.其中______________培养基应用广泛.2、为使培养基呈固体状态，需要在配制好的各营养成分的液体参加___________,溶化冷却即可.3、调节培养基的pH值,用浓度为1mol/L的_________或____________溶液进行调节.营养需要培养基牛肉膏蛋白胨琼脂HClNaOH4、对培养基进行灭菌就是要利用高温杀死_______________________________.压力要到达_________KPa,维持____________分钟.5、搁置斜面时培养基不能温度_____________否那么培养基会变成___________应趁热将试管放置成斜面形,使管内培养基形成的斜面长度不超过试管总长的______________.培养基中的一切微生物10020太低固体1/26、微生物接种时各项操作必须在_________条件下进行.因此必须在___________中操作.接种环境在___________上用灼烧去灭菌,双手用_______%的酒精消毒.7、接种时将灭菌的接种环挑取少许________,迅速插入培养基试管里,在斜面上由_________向________连连续划几道__________线,然后将试管口在火焰上灼烧,塞上_____________.无菌无菌箱酒精灯75菌体里外蛇形细棉塞例3：在锥形瓶中装入一定量液体培养基，接入N0个乳酸菌之后密封，放在250C温箱中连续培养假设干小时，其间每30分钟测定一次菌数，测得数量变化曲线如图。请分析答复。总细菌数/个

N0活细菌数/个培养时间/小时012345678〔1〕乳酸菌以__________方式生殖,这代表__________类生物普遍具有的生殖方式.分裂生殖

原核(2)用N表示总菌数,N0表示初始菌数,t表示增殖世代数,乳酸菌数量增长的数字表达式为N=N