第四章酶与酶工程

生物工程与技术导论第四章酶与酶工程知识网络4.1酶学基础酶与酶工程发展简史时间人物发现4000多年前的夏禹时代酿酒技术3000多年前的周朝制造饴糖、食酱等食品2500多年前的春秋战国麴治疗消化不良等疾病19世纪30年代开始人们才真正认识酶的存在和作用1833年佩恩（Payen）帕索兹（Persoz）乙醇沉淀麦芽的水抽提物得到可使淀粉水解生成可溶性糖的物质，称之为淀粉酶（diastase）19世纪中叶巴斯德（Pasteur）大量研究酵母的乙醇发酵，认为在活酵母细胞内有一种可以将糖发酵生成乙醇的物质1878年昆尼（Kunne）首次将酵母中进行乙醇发酵的物质称为酶，该词来自希腊文，意思

“在酵母中”1896年巴克纳（Buchner）兄弟酵母无细胞抽提液也能将糖发酵成乙醇，表明酶不仅在细胞内，细胞外也可以一定条件下进行催化作用促进了酶的分离以及对其理化性质的研究，一般认为酶学研究始于此4.1酶学基础酶与酶工程发展简史时间人物发现1902年亨利（Henri）根据蔗糖酶催化蔗糖水解的实验结果，提出中间产物学说，认为底物在转化成产物之前，必须首先与酶形成中间复合物，然后再转变为产物，并重新释放出游离的酶1913年米彻利斯（Michaelis）曼吞（Menton）根据中间产物学说，推导出酶催化反应的基本动力学方程—米氏方程。米氏方程的提出，是酶反应机理研究领域的一个重要突破1926年萨姆纳（Sumner）首次从刀豆提取液中分离纯化得到脲酶结晶，并证明它具有蛋白质的性质后来对一系列酶的研究，都证实酶的化学本质是蛋白质。在此后的50多年中，

“酶是具有生物催化功能的蛋白质”这一概念被普遍接受。4.1酶学基础酶与酶工程发展简史时间人物发现1960年雅各（Jacob）莫诺德（Monod）提出操纵子学说，阐明了酶生物合成的基本调节机制1982年切克（Cech）四膜虫细胞的26SrRNA前体具有自我剪接功能。认为RNA亦具有催化活性，并将具有催化活性的RNA称为核酸类酶1983年阿尔特曼（Altman）核糖核酸酶PRNA部分M1RNA具有核糖核酸酶P的催化活性，而该酶的蛋白质部分C5蛋白却没有酶活性RNA具有生物催化活性这一发现，改变了有关酶的概念。为此Cech和Altman共同获得1989年度的诺贝尔化学奖。研究表明，核酸类酶具有完整的空间结构和活性中心，有独特的催化机制，具有很高的底物专一性，其反应动力学亦符合米氏方程的规律。引出“酶是具有生物催化功能的生物大分子（蛋白质或RNA）”的新概念。4.1酶学基础酶的分类与命名蛋白质酶（P酶）的分类与命名国际酶学委员会（InternationalCommissionofEnzymes）：成立于1956年，受国际生物化学与分子生物学联合会（InternationalUnionofBiochemistryandMolecularBiology）以及国际理论与应用化学联合会（InternationalUnionofPureandAppliedChemistry）领导。该委员会一成立，第一件事就是着手研究当时混乱的酶的名称问题。对于蛋白类酶的分类和命名做了大量的工作。当时，酶的命名没有普遍遵循的准则，不可避免地产生混乱。确立酶的分类和命名原则，在当时是急需解决的问题。4.1酶学基础酶的分类与命名蛋白质酶（P酶）的分类与命名⑴有时相同的一种酶有两个或多个不同的名称例：催化淀粉水解生成糊精的酶，就有液化型淀粉酶、糊精淀粉酶、α-淀粉酶等多个名字。⑵有时一个名称却用以表示两种或多种不同的酶例：琥珀酸氧化酶名字，曾用于琥珀酸脱氢酶、琥珀酸半醛脱氢酶、NAD(P)+琥珀酸半醛脱氢酶等多种不同的酶。⑶有些酶的名称则令人费解

例：触酶、黄酶、间酶等。⑷有些酶的名称与发现者有关例：高峰淀粉酶来自日本学者高峰让吉的姓氏，他于1894年首次从米曲霉中制备得到一种淀粉酶制剂，用作消化剂。4.1酶学基础酶的分类与命名蛋白质酶（P酶）的分类与命名根据国际酶学委员会的建议，每一种具体的酶都有其推荐名和系统命名。推荐名是在惯用名称的基础上，加以选择和修改而成。酶的推荐名一般由两部分组成:底物名称+催化反应的类型。后面加

“酶”字（-ase）。正反应还是逆反应，都用同一个名称。例：葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase），表明该酶的作用底物是葡萄糖，催化的反应类型属于氧化反应。

对于水解酶类，催化水解反应，命名时可以省去说明反应类型的“水解”字样，只在底物名称之后加上“酶”字即可，如淀粉酶、蛋白酶、乙酰胆碱酶等。有时还可以再加上酶的来源或其特性，如木瓜蛋白酶、酸性磷酸酶等。4.1酶学基础酶的分类与命名蛋白质酶（P酶）的分类与命名系统命名更详细、更准确地反映出该酶所催化的反应。系统名称（systematicname）包括了酶的作用底物、酶作用的基团及催化反应的类型。例：葡萄糖氧化酶的系统命名为“β-D-葡萄糖：氧1-氧化还原酶”（β-D-glucose:oxygen1-oxidoreductase）。表明该酶所催化的反应以β-D-葡萄糖为脱氢的供体，氧为氢受体，催化作用在第一个碳原子基团上进行，所催化的反应属于氧化还原反应。4.1酶学基础酶的分类与命名蛋白质酶（P酶）的分类与命名蛋白类酶（P酶）的分类原则为：⑴按照酶催化作用的类型，将蛋白类酶分为6大类。第1大类，氧化还原酶第2大类，转移酶第3大类，水解酶第4大类，裂合酶第5大类，异构酶第6大类，合成酶（或称连接酶）⑵每个大类中，按照酶作用的底物、化学键或基团的不同，分为若干亚类。⑶每一亚类中再分为若干小类。⑷每一小类中包含若干个具体的酶。4.1酶学基础酶的分类与命名蛋白质酶（P酶）的分类与命名根据系统命名法，每一种具体的酶，除了有一个系统名称以外，还有一个系统编号。系统编号采用四码编号方法。第一个号码表示该酶属于6大类酶中的某一大类第二个号码表示该酶属于该大类中的某一亚类第三个号码表示属于亚类中的某一小类第四个号码表示这一具体的酶在该小类中的序号

每个号码之间用圆点（.）分开。4.1酶学基础酶的分类与命名蛋白质酶（P酶）的分类与命名例：葡萄糖氧化酶的系统编号为[EC1.1.3.4]。EC1.1.3.4表示国际酶学委员会EnzymeCommission表示第1大类，即氧化还原酶表示第1亚类，被氧化基团是CH-OH基团表示第3小类，氧为氢受体表示在小类中的特定序号4.1酶学基础酶的分类与命名核酸类酶（R酶）的分类与命名对于核酸类酶的分类和命名没有统一的原则和规定。R酶采用下列分类原则：⑴根据酶作用底物是其本身RNA分子还是其他分子，将核酸类酶分为两大类：分子内催化R酶和分子间催化R酶。⑵在每个大类中，根据酶的催化类型不同，将R酶分为若干亚类，如剪切酶、剪接酶和多功能酶等。⑶在每个亚类中，根据酶的结构特点和催化特性的不同，分为若干小类。⑷在每个小类中，包括若干个具体的R酶。⑸在可能与蛋白类酶（P酶）混淆的情况下，标明R酶，以示区别。4.1酶学基础酶的分类与命名核酸类酶（R酶）的分类与命名由于蛋白类酶和核酸类酶的组成和结构不同，命名和分类原则有所区别。为了便于区分两大类别的酶，有时催化的反应相似，命名却有所不同。例：催化大分子水解生成较小分子的酶，核酸类酶中属于剪切酶，蛋白类酶中属于水解酶；核酸类酶中的剪接酶可以催化剪切与连接反应，蛋白类酶中的转移酶亦催化相似的反应，可以从一个分子中将某个基团剪切下来，连接到另一个分子中去。4.1酶学基础酶的结构与作用特点酶的结构绝大多数酶的本质是蛋白，根据酶的组成成分，分为单纯酶和结合酶两类。单纯酶的结构组成中除蛋白外无其他成分，酶的活性决定于蛋白部分。结合酶的分子组成中除蛋白成分外，还有一些对热稳定的非蛋白小分子物质，其分子组成中的蛋白部分称酶蛋白，非蛋白小分子物质称辅助因子。酶蛋白与辅助因子结合形成的复合物称全酶，通常只有全酶才能起催化作用。在催化反应中，酶蛋白与辅助因子所起的作用不同，酶反应的专一性及高效性取决于酶蛋白，而辅助因子则起电子、原子或某些化学基团的传递作用。4.1酶学基础酶的结构与作用特点酶的结构直接与底物结合并和酶催化作用直接有关的区域叫酶的活性中心（activecenter）或活性部位（activesite）。酶的活性中心有两个功能部位：⑴结合部位：一定的底物靠此部位结合到酶分子上。⑵催化部位：底物的键在此处被打断或形成新的键，从而发生一定的化学变化。图4-1酶的活性中心4.1酶学基础酶的结构与作用特点酶的结构参与构成酶活性中心和维持酶特定构象所必需的基团称为酶的必需基团。酶的必需基团包括两大类：1）活性中心内的必需基团：活性中心内的一些化学基团，是酶发挥催化作用与底物直接作用的有效基团。2）活性中心外的必需基团：在活性中心外的区域，还有一些不与底物直接作用的必需基团，这些基团与维持整个酶分子的空间构象有关，可使活性中心的各个有关基团保持于最适的空间位置，间接对酶的催化活性发挥其必不可少的作用。4.1酶学基础酶的结构与作用特点作用特点⑴专一性酶的专一性是指在一定的条件下，一种酶只能催化一种或一类结构相似的底物进行某种类型反应的特性。酶的专一性绝对专一性相对专一性4.1酶学基础酶的结构与作用特点作用特点①绝对专一性：一种酶只能催化一种底物进行一种反应，这种高度的专一性称为绝对专一性。例：乳酸脱氢酶[EC1.1.1.27]催化丙酮酸进行加氢反应生成L－乳酸。4.1酶学基础酶的结构与作用特点作用特点核酸类酶也同样具有绝对专一性：

四膜虫26SrRNA前体等催化自我剪接反应的R酶，只能催化其本身RNA分子进行反应，而对于其它分子一概不作用。图4-2四膜虫26SrRNA前体4.1酶学基础酶的结构与作用特点作用特点②相对专一性：一种酶能够催化一类结构相似的底物进行某种相同类型的反应，这种专一性称为相对专一性。相对专一性又可分为键专一性和基团专一性。例：酯酶可催化所有含酯键的酯类物质水解生成醇和酸。键专一性的酶能够作用于具有相同化学键的一类底物。4.1酶学基础酶的结构与作用特点作用特点基团专一性的酶则要求底物含有某一相同的基团。例：核酸类酶M1RNA，催化tRNA前体5’-末端的成熟。要求底物核糖核酸的3’-端部分是一个tRNA，而对其5’-端部分的核苷酸链的顺序和长度没有要求，催化反应的产物为一个成熟的tRNA分子和一个低聚核苷酸。

例：胰蛋白酶[EC3.4.31.4]选择性地水解含有赖氨酰-或精氨酰-的羰基的肽键。图4-3胰蛋白酶选择性水解4.1酶学基础酶的结构与作用特点作用特点⑵高效性酶催化的转换数（每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数）一般为103min-1左右。酶催化和非酶催化反应所需的活化能有显著差别，如图所示，酶催化反应比非酶催化反应所需的活化能要低得多。图4-4酶与非酶催化所需的活化能4.1酶学基础酶的结构与作用特点作用特点⑶条件温和酶的催化作用一般都在常温、常压、pH近乎中性的条件下进行。一是由于酶催化作用所需的活化能较低；二是由于酶是具有生物催化功能的生物大分子。在高温、高压、在过高或过低pH等极端条件下，大多数酶会变性失活而失去其催化功能。图4-5酶的温和催化条件4.1酶学基础酶的结构与作用特点作用特点⑷可调节性①共价修饰调节：在其他酶的催化作用下，某些酶蛋白肽链上的一些基团可与某种化学基团发生可逆的共价结合，从而改变酶活性，此过程称为共价修饰。常见调节类型主要有：磷酸化与脱磷酸化，乙酰化和脱乙酰化，甲基化和脱甲基化，腺苷化和脱腺苷化等。图4-6磷酸化与脱磷酸化的共价修饰调节4.1酶学基础酶的结构与作用特点作用特点②变构调节：具有变构调节作用的酶称为变构酶，一般是寡聚酶，由多亚基组成，包括催化部位和调节（别构）部位。使酶分子变构并使其催化活性发生改变的物质称为效应物或变构剂。根据配体性质分为同促效应和异促效应；根据配体结合后对后继配体的影响分为正协同效应和负协同效应。4.1酶学基础酶的结构与作用特点作用特点变构酶的动力学曲线：V对[S]作图不服从米-曼氏（Michaelis-Menten）关系式，不呈直角双曲线，而是S形曲线（正协同）或表观双曲线（负协同）。图4-7变构酶的动力学特征4.1酶学基础酶的结构与作用特点作用特点③同工酶调节：在同一种属中，催化活性相同而酶蛋白的分子结构、理化性质及免疫学性质不同的一组酶称为同工酶（isoenzyme）。同工酶在体内的生理意义主要在于适应不同组织或不同细胞器在代谢上的不同需要。例：乳酸脱氢酶酶（LDH）为2种亚基构成的四聚体，在体内有5种分子形式即LDH1（H4），LDH2（H3M），LDH3（H2M2），LDH4（HM3）和LDH5（M4）。图4-8乳酸脱氢酶酶的五种同工酶4.1酶学基础酶的结构与作用特点作用特点图4-9胃蛋白酶的酶原激活调节④酶原激活调节：有些酶在细胞内合成或初分泌时只是酶的无活性前体，此前体物质称为酶原。在一定条件下，酶原向有活性酶转化的过程叫酶原的激活，例如胃蛋白酶的酶原激活调节。除了这四种常见的调节方式外，酶活性调节还有一些其它的调节方式。例：限制性蛋白水解作用、抑制剂与激活剂的调节等（略）。4.1酶学基础酶的作用机制专一性机制⑴三点附着学说（three-pointattachmenttheory）：认为酶与底物的结合处至少有三个点，而且只有一种情况是完全结合的形式。只有这种情况下，不对称催化作用才能实现。图4-10酶与底物“三点附着”示意图4.1酶学基础酶的作用机制专一性机制⑵锁钥学说（LockandkeyHypothesis）：1894年Fischer提出。认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状，酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样，即底物分子进行化学反应的部位与酶分子活性中心具有紧密互补的关系。图4-11酶与底物“锁钥”结构示意图4.1酶学基础酶的作用机制专一性机制⑶诱导契合学说（InducedfitHypothesis）：1958年Koshland提出。该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状，从而有利于底物的结合。图4-11酶与底物“诱导契合”示意图4.1酶学基础酶的作用机制高效能机制从热力学角度来看，酶催化的高效性主要是由于酶能降低反应的活化能（但不会改变反应平衡点）。综合来说，与降低反应活化能相关及酶催化效率相关的因素主要有如下几个方面：⑴广义的酸碱催化广义上的酸碱催化是指酶活性部位上的某些基团可以作为质子供体或质子受体对底物进行酸或碱催化。能供给质子的物质即为酸，能接受质子的物质即为碱，如下式所示：HA=A-+H+HA为酸，A-为碱HA（酸）+A=AXH（酸催化）AXH+B-（碱）=Y+BH+A-（碱催化）4.1酶学基础酶的作用机制高效能机制⑵共价催化某些酶在催化反应时，本身能放出或吸取电子并作用于底物的缺电子或负电子中心，并与底物以共价方式形成中间物。这种中间物可以很快转变为活化能大为降低的转变态，从而提高催化反应速度。按酶对底物所攻击的基团的不同，该催化方式又分为亲核催化（nucleophiliccatalysis）和亲电子催化（cetecrophiliccatalysis）。亲电试剂具有强烈亲和电子的原子中心，而亲核试剂具有强烈供给电子的原子中心。4.1酶学基础酶的作用机制高效能机制⑶邻近效应和定向效应邻近效应指双分子反应的两个底物分子相邻近时，提高了底物的有效浓度。而底物分子在活性中心的“定向”排布，有利于原子轨道的重叠—轨道定向，使分子间反应近似于分子内反应。图4-12邻近效应和定向效应示意图4.1酶学基础酶的作用机制高效能机制⑷变形或张力酶使底物分子中的敏感键发生变形或张力，从而使底物的敏感键更易于破裂。⑸表面效应酶的活性中心为酶分子的凹穴，此处多为非极性或疏水性的氨基酸残基的疏水区域。底物与酶的反应常在酶分子的内部疏水环境中进行，疏水环境排斥了介于底物与酶分子之间的水膜，从而消除了水分子对酶和底物功能基团的干扰，有利于底物与酶分子间的直接接触。总之，一种酶的催化反应常常是多种催化机制的综合作用，这是酶促反应提高效率的原因。4.1酶学基础酶促反应动力学酶促反应动力学是研究酶促反应速度及其影响因素的科学。酶的催化作用主要受到底物浓度、酶浓度、温度、pH值、激活剂浓度、抑制剂浓度等诸多因素的影响。米氏方程：V为反应速度，S为底物浓度，Vm为最大反应速度，Km为米氏常数，为酶催化反应速度等于最大反应速度一半时的底物浓度。4.1酶学基础酶促反应动力学底物浓度是决定酶催化反应速度的主要因素。V图4-13底物浓度与酶催化反应速度的关系底物浓度较低时，酶催化反应速度与底物浓度成正比，反应速度随着底物浓度的增加而加快。当底物浓度达到一定值时，反应速度的上升不再与底物浓度成正比，而是逐步趋向平衡。酶催化反应的基本动力学方程阐明了底物浓度与酶催化反应速度之间的定量关系。有些酶在底物浓度过高时，反应速度反而下降，这主要是由于高浓度底物引起的抑制作用。（一）底物浓度的影响4.1酶学基础酶促反应动力学在底物浓度足够高的条件下，酶催化反应速度与酶浓度成正比。它们之间的关系可以表示为：V=k[E]图4-14酶浓度与反应速率的关系每一种酶的催化反应都有其适宜温度范围和最适温度。在最适温度条件下，酶的催化反应速度达到最大，呈现出钟罩形曲线。图4-15温度与反应速度的关系（二）酶浓度的影响（三）温度的影响4.1酶学基础酶促反应动力学酶的催化作用与反应液的pH值有很大关系。每一种酶都有其各自的适宜pH值范围和最适pH。在最适pH值条件下，酶催化反应速度达到最大。图4-16pH值与反应速度的关系由于在不同的pH值条件下，酶分子和底物分子中基团的解离状态发生改变，从而影响酶分子的构象以及酶与底物的结合能力和催化能力。在极端的pH值条件下，酶分子的空间结构发生改变，从而引起酶的变性失活。（四）pH值的影响4.1酶学基础酶促反应动力学（五）抑制剂的影响酶的抑制剂是指使酶的催化活性降低或者丧失的物质，分为可逆性抑制剂和不可逆抑制剂。⑴不可逆抑制剂是指与酶分子结合后，抑制剂难于除去，酶活性不能恢复。抑制剂与酶的必需基团以共价键结合而引起酶失活。包括非专一性不可逆抑制的抑制剂和专一性不可逆抑制的抑制剂。①非专一性不可逆抑制的抑制剂作用于酶分子中一类或几类基团，而这些基团中包含了必需基团，因而引起酶失活。如金属离子、烷化剂、有机磷化合物、有机砷化合物、有机汞、氰化物、青霉素等。②专一性不可逆抑制类抑制剂选择性很强，只能专一性地与酶活性中心的某些基团不可逆结合，引起酶活性丧失。4.1酶学基础酶促反应动力学⑵可逆性抑制剂与酶的结合是可逆的，只要将抑制剂除去，酶活性即可恢复。根据可逆性抑制作用的机理不同，酶的可逆性抑制作用可以分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制三种。可逆性抑制竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制4.1酶学基础酶促反应动力学例：丙二酸是琥珀酸的结构类似物。丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。①竞争性抑制：指抑制剂和底物竞争与酶分子结合而引起的抑制作用。竞争性抑制剂与酶作用底物的结构相似。它与酶分子结合以后，底物分子就不能与酶分子结合，从而对酶的催化起到抑制作用。4.1酶学基础酶促反应动力学竞争性抑制的效果强弱与竞争性抑制剂的浓度、底物浓度以及抑制剂和底物与酶的亲和力大小有关。随着底物浓度增加，酶的抑制作用减弱。竞争性抑制酶催化反应的最大反应速度Vm不变，而米氏常数Km增大。图4-17线性竞争性抑制的Km和Vm变化4.1酶学基础酶促反应动力学②

非竞争性抑制：指抑制剂与底物分别与酶分子上的不同位点结合，而引起酶活性降低的抑制作用。由于非竞争性抑制剂是与酶的活性中心以外的位点结合，所以，抑制剂的分子结构可能与底物分子的结构毫不相关。增加底物浓度也不能使非竞争性抑制作用逆转。非竞争性抑制的酶促反应的最大反应速度Vm减小，而米氏常数Km不变。图4-18非竞争性抑制的Km和Vm变化4.1酶学基础酶促反应动力学图4-19反竞争性抑制的Km和Vm变化③反竞争性抑制：在底物与酶分子结合生成中间复合物后，抑制剂再与中间复合物结合而引起的抑制作用。反竞争性抑制剂不能与未结合底物的酶分子结合，只有当底物与酶分子结合以后由于底物的结合引起酶分子结构的某些变化，使抑制剂的结合部位展现出来，抑制剂才能结合并产生抑制作用。所以亦不能通过增加底物浓度使反竞争抑制作用逆转。反竞争性抑制的酶促反应的最大反应速度Vm和米氏常数Km均减小。4.1酶学基础酶促反应动力学④激活剂的影响：酶的激活剂或活化剂是指能够增加酶的催化活性或使酶的催化活性显示出来的物质。常见的激活剂有Ca2+、Mg2+、Co2+、Zn2+、Mn2+等金属离子和Cl-等无机负离子。例：氯离子（Cl-）是α-淀粉酶的激活剂，钴离子（Co2+）和镁离子（Mg2+）是葡萄糖异构酶的激活剂等。有的酶也可以作为激活剂，通过激活剂的作用使酶分子的催化活性提高或者使酶的催化活性显示出来。4.2酶的固定化1916年Nelson和Griffin最先发现了酶的固定化现象。1953年Grubhofer和Sohleith首先将酶等用重氮化聚氨基聚苯乙烯树脂进行固定。1969年日本的千烟一郎博士首次将固定化酶应用于工业生产，开辟了固定化酶工业化应用的新纪元。固定化酶最初将水溶性酶与不溶性载体结合起来，成为不溶于水的酶的衍生物。后来发现也可以将酶包埋在凝胶内或置于超滤装置中，高分子底物与酶在超滤膜一边，而反应产物可以透过膜逸出。在这种情况下，酶本身是可溶的。1971年召开的第一届国际酶工程会议正式建议采用“固定化酶”（Immobilizedenzyme）的名称。4.2酶的固定化易于将固定化酶与底物、产物分开，固定化酶可重复使用；固定化酶具有一定的机械强度，使反应过程能够管道化、连续化和自动化；在大多数情况下，酶在固定化后稳定性得到较大提高，可较长期地使用或贮藏等。固定化酶与游离酶相比，具有明显优势。4.2酶的固定化酶的固定化策略依据载体的性质，酶的固定化方法主要分为吸附法、结合法、包埋法及交联法四大类。酶的固定化方法⑴吸附法利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面而使酶固定化的方法称为吸附法。吸附法包括物理吸附和离子结合法。优势：工艺简便、条件温和，酶活性中心不易被破坏，酶高级结构变化少，酶失活后可重新活化，载体价廉易得，再生反复使用，载体选择范围很大，吸附过程同时达到纯化和固定化。缺点：酶与载体相互作用力弱，易受反应介质的pH、离子强度等的影响而从载体上脱落。4.2酶的固定化酶的固定化策略酶的固定化方法⑵包埋法单体和酶溶液混合，再借助引发剂进行聚合反应，将酶固定于载体材料的网格中，不需要化学修饰酶蛋白的氨基酸残基，反应条件温和，很少改变酶结构的固定化方法。固定化时保护剂和稳定剂的存在不影响酶的包埋产率。包埋法又分为凝胶包埋法和微囊化法。图4-20包埋法固定化酶示意图4.2酶的固定化酶的固定化策略酶的固定化方法图4-21结合法固定化酶示意图⑶结合法酶蛋白分子上的功能团和固相支持物表面上的反应基团之间形成化学共价键连接以固定酶的方法。根据酶与载体结合的化学键不同，结合法分为离子键结合法和共价键结合法。4.2酶的固定化酶的固定化策略酶的固定化方法图4-22交联法固定化酶示意图⑷交联法不使用载体，利用双功能或多功能试剂在酶分子间、酶分子与惰性蛋白间，或酶分子与载体间进行交联反应，以共价键制备固定化酶的方法。最常用的交联试剂是戊二醛。4.2酶的固定化酶的固定化策略酶的固定化方法⑸其它固定化方法①热处理法：将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而制备得到固定化菌体。例：将培养好的含葡萄糖异构酶的链霉菌细胞在60～65℃的温度下处理15min，葡萄糖异构酶全部固定在菌体内。②介孔材料固定法：以介孔材料为固定化载体。例：介孔分子筛是一种具有六方有序规整孔道排列和窄孔径分布的新型材料，通过表面的可反应基团与酶分子结合。③纳米材料固定法：纳米载体比表面积大，如果能结合纳米材料的磁、电等物理特性，在磁场或电场等条件下分离，将大大拓展酶的纳米级固定化载体的适用范围。例：磁性高分子微球4.2酶的固定化各酶固定化方法的优缺点比较不同的固定化方法具有不同的特点，因此有不同的适用范围。一般来说，对于一个特定酶的固定化来说，要根据酶学性质、固定化材料特性以及成本因素来选择其固定化方法。特性物理吸附法离子结合法包埋法共价结合交联法制备易易易难难结合力中弱强强强酶活力高高中中中底物专一性无变化无变化无变化有变化有变化再生能能不能不能不能固定化费用低低中中高表4-1各酶固定化方法的比较4.2酶的固定化固定化酶的性质变化酶分子固定化后，从游离态变为结合态，处在一个与游离态酶完全不同的微环境中，微环境的许多性质会因此而影响酶原有的性质。固定化酶的稳定性好，最适温度升高。最适pH值因载体带电性质与产物性质的影响而发生变化；载体的空间位阻，固定化酶的底物特异性可能有些不同，与底物分子量的大小有一定关系；固定化酶的米氏常数（Km）也会发生一定的改变。总体来说，固定化酶性质取决于酶、底物及载体材料的性质：酶固定化后的变化主要是活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生变化；载体影响主要是在固定化酶的周围形成了能对底物产生立体影响的扩散层及静电相互作用等引起的变化。4.2酶的固定化辅酶的固定化辅酶（coenzyme）是一类可以将化学基团从一个酶转移到另一个酶上的有机小分子，与酶较为松散地结合，对于特定酶的活性发挥是必要的。许多维生素衍生物，如核黄素、硫胺素和叶酸，都属于辅酶。固定化辅酶最大挑战在于如何完成固定化酶体系的辅酶原位再生。辅酶的相对分子量只有几百，要将其包埋在半透膜比较困难，若将辅酶与不溶性载体结合，则不能在多个酶之间传递作用。目前都是辅酶高分子化来解决。辅酶的高分子化是先将辅酶的一定部位进行修饰，引入适当的功能团或间隔臂，生成辅酶衍生物，再与水溶性高分子结合。4.2酶的固定化辅酶的固定化辅酶的固定化一般需遵循三个原则：⑴选择合适的载体，常用的是琼脂糖、纤维素、合成高分子载体；⑵间隔臂选择适当，一般辅酶和载体间手臂为0.5~1.0nm；⑶考虑到辅酶的性质，如疏水性、离子性和体积大小等。辅酶固定化在方法上与酶相似，主要应用共价偶联法。如溴化氰法，碳二亚胺法以及重氮偶联法等。(a)辅酶与酶共固定在载体上在酶分子上图4-23辅酶的固定化4.2酶的固定化固定化酶的表征⑴固定化酶（细胞）的活力指每毫克干重固定化酶（细胞）每分钟转化底物（或生成产物）的量。⑵偶联率及相对活力偶联率=（加入蛋白活力－上清液蛋白活力）／加入蛋白活力×100%相对活力=固定化酶总活力／（加入蛋白活力－上清液中未偶联酶活力）×100%活力回收=固定化酶总活力／加入酶的总活力×100%⑶固定化酶（细胞）的半衰期指在连续测定时，固定化酶（细胞）的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以t1/2表示。没有扩散限制时，半衰期t1/2=0.693/KD，KD称为衰减常数。4.3非水相酶催化非水相酶催化概述传统观念认为，只有在水溶液中酶才具有催化活性。1984年美国麻省理工大学学者用脂肪酶在几乎无水的有机溶剂中成功地催化合成了肽、手性醇、酯和酰胺，打破了认为有机溶剂是酶的变性剂的这一传统观念。随后许多学者相继投入该研究领域，使得传统酶学领域迅速成长出一个全新的分支—非水酶学（NonaqueousEnzymology）。酶在非水介质中进行的催化作用称为酶的非水相催化反应。在非水相中，酶分子受到非水介质的影响，其催化特性与在水相中催化有着较大的不同。4.3非水相酶催化非水相酶催化概述指以含微量水的有机溶剂为介质的反应体系。例：吡啶中枯草杆菌蛋白酶催化的选择性酰化反应。该反应可以专一性得到1位选择性酰化产物，传统的化学法是无法区分这些二级羟基的，显示了非水相酶法合成的优越性。（一）微水有机溶剂单相体系图4-24枯草杆菌蛋白酶催化的选择性酰化反应酶的非水相体系主要包括以下几种：4.3非水相酶催化非水相酶催化概述（二）水-有机溶剂单相体系指在水中加入有机助溶剂或共溶剂而形成的与水互溶的均相系统。常用助溶剂：二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、丙酮和低级醇等。由于形成均相系统，因此通常不会发生传质障碍。如果系统中有机溶剂的比例高过某阈值或亲水性过强，将夺去酶分子表面的必需水，使酶失活。少数稳定性很高的酶，如南极假丝酵母脂肪酶，只要水互溶有机溶剂中有极少量的水，就能保持它们的催化活性。水互溶有机溶剂体系还能降低反应体系的冰点温度，这是低温酶学研究的内容之一。4.3非水相酶催化非水相酶催化概述指由水和非极性有机溶剂组成的非均相反应系统。酶溶解于水相，底物和产物溶解于有机相。常用的水不溶性溶剂有烃类、醚、酯等。例：珊瑚诺卡菌（氧化酶）生物转化烯烃产生的环氧化物被及时地转移到有机相中，可使其对微生物的毒害降低。巨大芽孢杆菌环氧水解酶催化的缩水甘油苯基醚的对映体选择性开环水解反应也适合于在两相系统（异辛烷）中进行，由于底物和产物大部分溶解在有机相中，因此可以减少其自发水解和对酶的抑制作用。（三）水-有机溶剂两相体系4.3非水相酶催化非水相酶催化概述某些强极性有机溶剂可替代反应体系中的微量“必须”水，使酶在“高燥”的有机介质中仍然表现出一定的催化活性。这些强极性有机溶剂被称为“仿水溶剂”。仿水溶剂通过形成氢键与酶蛋白分子相互作用，使酶分子具有一定的柔性构象，从而改善其催化活性和对映体选择性。这类仿水溶剂主要有乙腈、二甲基甲酰胺、乙二醇、丙三醇等。（四）仿水溶剂体系仿水溶剂只能作为辅助溶剂部分替代水，而不能完全替代水的作用。这是因为干燥的酶水合时要经过几个阶段，其中某个阶段（可能是最初的离子化阶段）是不可能完全被仿水溶剂替代的。仿水溶剂替代水的意义在可以控制和消除由水而引起的逆反应和水解等副反应。辅助溶剂的体积分数反应初速度/[umol/(L·h·mg)]辅助溶剂的体积分数反应初速度/[umol/(L·h·mg)]无01%水+9%甘油8201%水191%水+9%乙二醇单醚1404%水35001%水+9%乙二醇二甲醚601%水+9%甲酰胺38001%水+9%二甲基甲酰胺(DMF)511%水+9%乙二醇15009%甲酰胺04.3非水相酶催化非水相酶催化概述（五）微乳液/反胶束体系微乳液是由水、表面活性剂以及非极性有机溶剂等构成的宏观均匀、微观多相的热力学稳定体系。低水含量的油包水（W/O）微乳液又称为反胶束。水含量少（Wo<15）的聚集体通常称为反胶束；水含量多（Wo>15）的聚集体通常称为微乳液。图4-25反胶束结构示意图4.3非水相酶催化非水相酶催化概述（六）超临界流体体系超临界流体是处于临界温度和临界压力以上，介于气体和液体之间的高密度流体。其具有和液体同样的凝聚力、溶解力；然而其扩散系数又接近于气体，是通常液体的近百倍。例：用作超临界流体的溶剂有氟利昂、烷烃类（甲烷，乙烯，丙烷）、无机化合物（CO2，H2O，N2O）等。酶在这些溶剂中具有与在亲脂性有机溶剂中一样的稳定，适于多数酶催化的酯化、转酯、醇解、水解、羟化和脱氢等反应。4.3非水相酶催化非水相酶催化概述（七）离子液体体系离子液体（Ionicliquid,IL）是只由离子构成且在常温下呈液态的化合物，为一种低熔点的盐，其性质依赖于它所包含的阴阳离子。离子液体没有可观测蒸气压，热稳定性好，溶解多种混合物，还可以与多种溶剂组成两相体系。离子液体的极性、亲水性/亲脂性和溶解性能可以通过改变不同的正负离子及其烷基碳链的长短进行调节，因此又被称为可设计的溶剂。例：溴化乙基吡啶、氯化1-甲基-3-乙基咪唑等。图4-26几种常见的离子液体4.3非水相酶催化非水相酶催化概述（八）拟低共熔体系两种固态不互溶的底物按一定比例混合时在一定温度下（低共熔点）能形成低共熔的状态。固、液同时存在，酶促反应能在高底物浓度下进行。然而既适合酶促反应的温度及反应用酶，又符合严格的物化概念上的低共熔二元反应底物体系，实际上是很难找到的。往往加入极少量的第三、第四液相组份来产生反应所需的液相形成固-固-液悬浮体系，或一种反应底物以液态存在，另一种反应底物以固态存在而形成液-固悬浮体系，即拟低共熔体系（Pseudoeutecticsystems）。4.3非水相酶催化非水相酶催化概述（九）无溶剂体系无溶剂有机合成体系有以下几种形式：（1）反应物均为液体（2）其中的一种反应物为固态，一种为液体（3）两种反应物均为固体（4）一种反应物为气体，另一种为固体。

其中后两种形式称为固态反应体系。4.3非水相酶催化非水相酶催化概述（九）无溶剂体系无溶剂合成是有机合成的一种新方法。无溶剂条件下的酶催化反应表现出明显的优越性：1）克服了溶剂对酶催化活性和选择性的影响；2）底物浓度达最大值而不必考虑底物浓度对酶活性的影响；3）具有污染少、成本低、产率高、反应过程和处理过程简单等优点。4.3非水相酶催化非水相酶催化概述（十）气相体系采用生物酶的气固相反应器已用于单步的生物转化，所用生物酶包括氢化酶、醇氧化酶、醇脱氢酶、脂肪酶等。酶用于气相催化是一种可行的新技术，未来可能用于生产香料一类的挥发性产品，也可用于移出气体中的有毒物质，以及用于生物传感器等。对于生物酶和细胞的气相催化反应研究还有大量的工作要做。4.3非水相酶催化非水相酶催化的反应类型⑴氧化反应：醇、酚以及羧酸等的氧化⑵还原反应：催化醛类或酮类还原成醇类（一）氧化-还原反应4.3非水相酶催化非水相酶催化的反应类型（二）转移反应4.3非水相酶催化非水相酶催化的反应类型（三）醇解/氨解反应

例：假单胞脂肪酶催化酸酐醇解生成二酸单酯化合物：再如脂肪酶4.3非水相酶催化非水相酶催化的反应类型（四）合成反应（五）异构反应（六）裂合反应4.3非水相酶催化非水相酶催化的影响因素有机溶剂主要通过以下三种途径发生作用：（1）有机溶剂与酶直接发生作用，酶分子本身的动态结构及表面结构发生变化：改变蛋白分子的动态移动性来影响酶的活力；酶分子与溶剂的直接接触，蛋白质分子表面结构发生变化；减少整个活性中心的数量（活性中心滴定法测定），溶剂为非极性时影响更明显。（2）有机溶剂可以直接和酶分子周围的水相互作用，一些夺取酶表面的必需水而导致酶失活。（3）有机溶剂和能扩散的底物或反应产物相互作用影响反应的进行。（一）有机溶剂4.3非水相酶催化非水相酶催化的影响因素水在酶催化反应中发挥着双重作用：⑴水分子直接或间接地通过氢键及范德华力等非共价键作用来维持酶的催化活性所必需的构象；⑵水是导致酶的热失活的重要因素，有水存在时随着温度的升高酶分子会发生变化而失活。

因此，在非水相酶反应体系中进行的酶促反应的最适含水量不仅与酶的种类及用量、底物浓度有关，也与选用的溶剂有关。各种酶因结构不同，维持酶活性构象的必需水也不同，大部分酶需较高的水活度aw才表现较好的活力；不同反应酶所需的最适水量也不同。（二）水4.3非水相酶催化非水相酶催化的影响因素添加剂主要分为以下几个类型：⑴无机盐类添加剂：改变酶在非水相介质中的构象。⑵有机助溶剂：增加疏水性底物的溶解度，从而增加底物浓度。⑶多醇类添加剂：较强的亲水性影响酶必需水层的微环境，提高酶催化活性的作用称为“溶剂活化”，抑制酶催化活性的作用称为“溶剂抑制”。⑷表面活性剂：可影响底物的分散状况；离子型表面活性剂因其带电基团与酶分子间的静电作用影响酶构象；非离子表面活性剂与酶分子间仅有氢键和疏水作用，影响较小。（三）添加剂4.3非水相酶催化非水相酶催化的影响因素生物印迹（bioimprinting）是指以天然生物材料如蛋白质和多糖为骨架进行分子印迹而产生对印迹分子具有特异性识别空腔。利用酶与配体的相互作用，诱导、改变酶的构象，制备具有结合该配体及其类似物能力的“新酶”，即印迹酶。酶在含有其配基的缓冲液中，肽键和配体之间的相互作用使酶的构象改变，这种新构象在去除配体后在无水有机溶剂中仍可保持，即具有“记忆”性。例：当枯草杆菌蛋白酶从含有竞争性抑制剂（N-Ac-Tyr-NH2）的水溶液中冻干出来后，再将抑制剂除去，该酶在辛烷中催化酯化反应的速度比不含抑制剂的水溶液中冻干出来的酶高100倍，但在水溶液中其活性与未处理的酶相同。（四）生物印迹4.3非水相酶催化非水相酶催化的影响因素利用两亲分子共价或非共价修饰酶分子表面，可以增加酶表面的疏水性，使酶均一地分散于有机溶剂，从而提高酶的催化效率和稳定性。智能水凝胶是一种对环境敏感的能够显著地溶胀于水中但并不溶解的亲水性聚合物。用智能水凝胶共价修饰酶，使酶能在均相条件下进行催化，反应结束后酶又能从体系中沉淀出，因此可看作一种兼有可溶性酶均相催化和固定化酶稳定性高的修饰酶。（五）化学修饰4.3非水相酶催化非水相酶催化的影响因素（六）固定化载体在有机介质中进行酶催化反应时，使用合适的载体对酶进行固定可以调节和控制酶的活性与选择性。例：介面酶类如脂肪酶等直接加入到有机溶剂中进行反应时它们常聚集成团而不利于发挥催化作用，因此固定化是非常必要的。酶经固定化后可以提高其在有机溶剂中的分散性和热力学稳定性，有利于酶的回收和连续化生产。4.3非水相酶催化非水相酶催化的影响因素（七）温度、pH与离子强度⑴温度的影响：

温度较低时升高温度能提高酶促反应速度；

温度过高则会导致酶失活；

温度对酶的选择性产生影响，温度低时选择性高。⑵pH与离子强度是影响酶催化的重要因素，其决定酶分子活性中心基团的解离状态和底物分子的解离状态，从而影响酶与底物的结合和催化反应。4.3非水相酶催化非水相酶催化的影响因素（八）超声辐射超声对酶促反应的作用主要包括机械作用、加热作用和空化作用。适度超声：

降低溶液粘度和表面张力，从而加强传质；

使酶分子的构象微小变化，使其超微结构更具柔性，有利于非水介质中的底物分子进入酶活性中心，也有利于产物分子进入介质；

使生成的水再分配，避免新生成的水在酶分子表面形成较厚的水化层而影响传质，并使酶的有效表面积增加。持续超声：导致有机溶剂中少量水分子的重新分布，阻止酶分子周围水膜的形成，从而对酶促反应产生负面影响。4.3非水相酶催化非水相酶催化的影响因素（九）其它技术蛋白质工程技术（定点突变）、进化酶技术、抗体酶技术、模拟酶技术等都是改变酶在有机介质（非天然条件）中的催化活性、稳定性和选择性的重要手段，近年来这方面的研究也得到了较快的发展。例：枯草杆菌蛋白酶经六点定位突变后，在二甲酰胺中的稳定性提高了60倍；南极假丝酵母脂肪酶活性中心附近的氨基酸残基突变后，在环己烷中催化4-庚醇和丁酸乙烯酯的选择性常数提高了270倍。4.4酶与酶工程的应用酶与酶工程的应用概况目前业已发现的酶有5000种左右，其中已经利用的有150种左右，工业生产的酶约60多种，而大量生产的只有20多种，占已知酶的很小一部分（约0.4%），其中80%为水解酶，而自然界中大量存在的生化反应是氧化还原反应，氧化还原酶的工业应用价值急待开发。随着遗传工程的普及，现在工业用微生物酶的80%以上已是