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气血并治方及其配伍药对对高脂血症大鼠脂质代谢、血小板聚集性及血小板活表达率的影响
“药对”是恢复复合物的基础。以医学实例为出发点,对阐明中医的理、法、方法,以及中药联合用药的规律具有重要意义。气血并治方由传统名方血府逐瘀汤化裁而来,是临床用于治疗动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的有效方药。在前期药理实验证明其有抑制炎症因子作用的基础上,进一步观察气血并治方及方中配伍药对对实验大鼠血脂、血小板活化、血小板黏附聚集的影响,了解它们的作用强度和作用环节的差异。材料和方法1.实验材料1.1对胡萝卜干醇提物的提取气血并治方醇提取物(由川芎、赤芍、枳壳、柴胡等组成),提取率为22.1%,活血药对川芎-赤芍醇提物,提取率为22.3%;理气药对柴胡-枳壳醇提物,提取率为26.6%;活血理气药对柴胡-赤芍醇提物,提取率为32.0%。以上制剂由中国科学院大连化学物理研究所制备。血脂康胶囊(主要成分红曲,每粒含辛伐他汀2.5mg),由北京北大维信生物科技有限公司生产,批号:20010302。1.2动物Wistar大鼠,60只,雌雄各半,体重180~220g,由中国科学院遗传研究所实验动物中心提供,合格号:京动字(1999)036。1.3脂质分子part-转甲基co认同lipproin,ldl-c胆固醇(cholesterol,TC),批号:010116;甘油三酯(triglyceride,TG),批号:010126,由北京中生生物工程高技术公司生产;高密度脂蛋白(highdensitylipoprotein,HDL-C),批号:010212;低密度脂蛋白(lowdensitylipoprotein,LDL-C),批号:010215,由北京利德曼生化技术有限公司生产;脂蛋白[lipoprotein(α),LP(α)]试剂盒,批号:0002601,上海明华体外诊断试剂有限公司生产;肾上腺素(adrenalinehydrochloride)注射液,批号:20010103,北京永康制药厂生产;胶原(collagen,COL),批号:702L01,美国BiopoolInternationgal公司生产;血小板活化CD62p一抗(rabbitanti-rat),批号:MO63261,二抗(anti-rabbit-FITC),批号:MO48707,由美国BD-Pharminugen公司生产。2.实验方法2.1动物分组、给药与注射动物饲养1周后,随机分组,每组10只,除空白组外,其余各组同时给予高脂饲料(高脂饲料:4%胆固醇、10%猪油、0.2%甲基硫氧嘧啶、0.5%胆盐、85%普通饲料),喂高脂饲料7d后,实验所用动物分为实验药物组、阳性对照组、空白组和模型组。实验药物组:给予4个不同药物的醇提取物,用自来水稀释相应浓度,灌胃给药。共分为(1)空白组:10ml/kg生理盐水,喂普通饲料。(2)模型组:10ml/kg生理盐水;(3)阳性对照组:血脂康胶囊0.108g/kg;(4)全方醇提取物组(全方组):6.3g(生药)/kg;(5)川芎、赤芍醇提取物组(川芎-赤芍组):2.7g(生药)/kg;(6)柴胡、赤芍醇提取物组(柴胡-赤芍组):1.79g(生药)/kg;(7)柴胡、枳壳醇提取物组(柴胡-枳壳组):1.35g(生药)/kg。第2周开始给药,连续2周。除空白组外,其余各组继续喂食高脂饲料,空白组、模型组灌胃等量水。末次给药后,禁食不禁水12h,下午4时,对各组动物(除空白组外)均腹腔注射1mg/kg的肾上腺素生理盐水溶液。第二天,再次给予各组动物(除空白组外)注射肾上腺素生理盐水溶液。1h后麻醉,腹主动脉取血,进行血脂、血小板聚集、血小板活化指标的检测。2.2血小板聚集检测TC,CHOD-PAP方法;TG,GPO-PAP方法;HDL-C、LDL-C,直接测定法;LP(α),比浊法;以上血脂测定用全自动生化仪,型号:RX-2000,美国TECHNICON公司生产。血小板聚集性(plateletagglutination,PAGT),采用比浊法,诱导剂为胶原(1.9mg/ml),仪器为LBY-NJ2型血小板聚集仪,北京普利生公司生产。血小板活化表达率(CD62p)采用流式细胞检测法,仪器为ELITE型,美国COUITER公司生产。2.3统计处理对大鼠血清生化指标的影响结果见表1,大鼠喂高脂饲料后,血清胆固醇含量显著升高,同时LDL-C、LP(α)含量也显著升高,模型组与空白组比较有明显差异(P<0.01)。各给药组对TC均有显著降低作用,并对LDL-C也有显著降低作用,与模型组比较有明显差异(P<0.05和P<0.01)。全方组对TG有显著降低作用,和模型组比较有明显差异(P<0.05);由于动物模型为外源性高脂饲料喂养,血清胆固醇升高的同时,HDL-C也显著升高,模型组和空白组比较有明显差异(P<0.05),柴胡-枳壳组能降低HDL-C含量,与模型组比较差异显著(P<0.05)。全方组、柴胡-赤芍组、柴胡-枳壳组对LP(α)均有显著降低作用,与模型组比较有明显差异(P<0.05)。结果见表2。全方组、川芎-赤芍组对大鼠血小板聚集性有显著抑制作用,和模型组比较有明显差异(P<0.05)。大鼠注射肾上腺素后血小板活化程度显著升高,模型组与空白组比较差异显著。柴胡-赤芍组和柴胡-枳壳组对大鼠血小板活化阳性表达率均有显著抑制作用,和模型组比较有明显差异(P<0.05)。各组对血小板平均荧光强度均无显著作用(P>0.01)。血小板膜活性氧合酶活性检测研究及阐明复方配伍规律是方剂研究中的关键环节,药对研究是中药复方研究的重要方法之一。中药复方是中医治病优越性的体现,中药单味药向复方演变的临床实践过程中,药对配伍起到了重要作用,药对可以增强药物的治疗作用及疗效,也可扩大药物临床治疗的范围,并奠定了中药方剂组成的基础。气血并治方是由活血化瘀名方血府逐瘀汤化裁而来,其中就包括川芎与赤芍、柴胡与枳壳等药对。本实验将高脂饮食与应激反应结合制造动物高血脂血瘀模型,模拟动脉粥样硬化初期病变,以脂质代谢、血小板功能等为指标,观察气血并治方全方及其配伍药对作用强度和作用环节的差异。高脂血症是机体发生动脉粥样硬化的基本因素。随着社会竞争日益激烈,与应激有关疾病逐渐增多。给大鼠注射外源性肾上腺素,引起动物应激性反应,体内血管明显收缩,使红细胞聚集性增强,血液黏度升高,造成应激性的血瘀证。高脂血症是痰浊的生化物质基础,由高脂所化生的痰浊,使血液黏稠性增高,血浆流动性降低、聚集性增高,最终导致内皮细胞损伤。血小板的活化可促进动脉血管壁粥样硬化和血栓形成的病理过程,血小板膜表面具有多种整合素(integrin)家族由糖蛋白构成的受体,其中CD62p(P选择素)主要存在于血小板的α颗粒膜上。在正常血液循环过程中,血小板处于静止状态,而发生血管壁损伤,血小板就会被激活,并通过其表面α颗粒(膜糖蛋白)迅速与血小板质膜融合在血小板的膜面上产生大量的表达。动脉内膜的脂质浸润已被认为是AS形成的主要原因,高脂血症时往往损伤内皮细胞,改变了内皮细胞的部分正常功能,促使血小板活化、粘附聚集和释放。胆固醇水平升高是动脉硬化病变的主要危险因素,而低密度脂蛋白(LDL)升高被认为是导致动脉硬化的独立危险因素。LP(α)是独立的一类脂蛋白,与动脉粥样硬化有明显的相关性,多数学者一致公认LP(α)是冠心病的一个独立危险因素。气血并治方中川芎、赤芍活血行气,散瘀止痛;柴胡、枳壳舒肝解郁、理气宽中。全方共奏活血化瘀、理气止痛之功效。其醇提取物主要活性组分为黄酮类、总苷类、有机酸类等,现代药理研究表明芍药苷有扩张血管壁、增加冠脉血流量以及能抑制血小板聚集、增加血小板cAMP水平等作用。而柴胡皂苷具有抗炎和促进血浆胆固醇代谢周转作用。川芎-赤芍药对是活血药,其主要活性成分有苷类(赤芍)、有机酸(川芎和赤芍);柴胡-枳壳药对是理气药,其主要活性成分有黄酮类(枳壳、柴胡)、柴胡皂苷(柴胡);柴胡-赤芍药对是理气活血药对,活性成分是黄酮类(主要来于柴胡)、柴胡皂苷(柴胡)、苷类、有机酸(赤芍)。实验表明全方组及其配伍药对对TC均有显著降低作用,并对动物LDL-C也有显著降低作用。全方组对TG有显著降低作用。全方组、柴胡-枳壳组、柴胡-赤芍组对LP(α)有显著降低作用。全方组和川芎-赤芍组对血小板聚集性有显著抑制作用;而柴胡-赤芍组和柴胡-枳壳组对血小板活化阳性表达率具显著抑制作用。从上可以看出,全方在作用强度方面有一定优势,在降脂和抗血小板活化、
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