一种新的毒力因子cbp基因的克隆及原核表达

一种新的毒力因子cbp基因的克隆及原核表达

绵羊感染病毒（orf.v）是天花病毒科的副银屑病病毒成员。他对皮肤和粘膜上的感染非常感兴趣。它主要由人类感染，如绵羊、山羊和其他动物，以及人类急性、高度接触性感染。临床应用于嘴唇、舌头、鼻子、乳房和尾根等部位。该病传染性强,发病率高,其中以羔羊最为易感,也可通过直接接触使人发生感染,引起与人手足口病相类似的临床症状。因此,该病的发生不仅给养羊业造成了巨大的经济损失,亦对人类的健康构成严重威胁。由于ORFV在免疫学上的特殊性,在初次感染痊愈后它可以再次感染宿主。研究发现,由该病毒编码的几种免疫调节因子可抑制机体的免疫反应从而使宿主发生再感染,这些免疫调节因子主要包括CBP、IL-10、血管内皮生长因子(VEGF)和GM-CSF抑制因子(GIF),它们能够聚集在一起抑制炎症反应和天然免疫,并延误获得性免疫的产生,从而使宿主发生再感染。为了进一步弄清ORFV在宿主体内的感染过程,并能更好的预防该病的发生。本研究对该毒株的CBP基因进行克隆和表达,并对该蛋白表达特性及生物活性进行分析,借以了解ORFVCBP基因的分子特性以及其编码蛋白的功能,进一步了解其在宿主机内如何发挥调节作用,这将为宿主如何对抗病毒感染提供新思路,并为进一步探究ORFV的致病机制提供理论依据。1材料和方法1.1x-4t-1载体ORFV-JL分离株、大肠杆菌BL21(DE3)、pGEX-4T-1载体由本实验室保存。rTaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、DNA限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ购自TakaRa,质粒抽提、胶回收试剂盒购自华大中天。1.2重组病毒dna的构建用MiniBEST病毒DNA提取试剂盒提取病毒基因组DNA,操作按试剂盒说明书进行。根据GenBank中羊传染性脓疱皮炎病毒CBP基因序列,用PrimerPremier5.0软件设计并合成特异性引物(引物由华大基因合成),引物P1、P2的5′端分别引入了BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点(下划线标示)P1:5′-CGGGATCCCGGCTCTACACTCCCAGCAACAT-3′(下划线标示为BamHⅠ酶切位点),P2:5′-CGGAATTCCGGAGCAGCGAGAAGTCAAAGT-3′(下划线标示为EcoRⅠ酶切位点)以提取的病毒基因组DNA为模板,采用25μL的PCR反应体系,PCR扩增目的基因片段。PCR体系为:15.25μL灭菌水,2.5μL10×PCRBuffer,4.0μLdNTPs(2mmol/L),P1、P2(25pmoL/L)各1μL,模板2μL,rTaq酶0.25μL。反应条件为:95℃预变性5min;95℃30s,56℃30s,72℃40s,30个循环;72℃延伸10min。取5μL反应液在1.0%琼脂糖凝胶上电泳,检测扩增结果。1.3dh5感受态细胞的构建用凝胶回收试剂盒回收目的片段,将其与pMD18-T载体相连,16℃连接8h。参照常规的氯化钙法制备DH5α感受态细胞。连接产物转化至DH5α感受态细胞,经蓝白斑筛选可能插入目的片断的白色菌落。挑取单个白色菌落,接种于含1‰Amp的LB液体培养基中,37℃180r/min培养过夜,用质粒提取试剂盒提取质粒,酶切鉴定筛选阳性质粒菌种,送华大基因测序阳性克隆命名为pMD-CBP。1.4rt-pcr和双酶切鉴定将构建的pMD-CBP质粒和原核表达载体pGEX-4T-1分别使用BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切,回收CBP基因和线性pGEX-4T-1,用T4DNA连接酶对回收的目的片段与线性载体进行连接,连接产物转化BL21感受态细胞,提取质粒,通过PCR和双酶切鉴定筛选阳性克隆,并对阳性克隆进行序列测定。1.5iptg诱导的质粒转化菌的构建将阳性重组质粒pGEX-4T-1-CBP转化BL21感受态细胞,接种于5mL含有100mg/L接入Amp抗性的LB液体培养基中,37℃振荡过夜,次日按1∶100的比例接入新鲜Amp抗性的LB培养基中,振摇至D600值达到1.0～1.2之间,吸取1mL菌液作为阴性对照,剩余菌液分别加入不同浓度的IPTG(0.05、0.1、0.5、1mmoL/L)进行诱导,分别于培养3、4、5、6、7h收集菌液,离心后收集沉淀和未经IPTG诱导的重组载体质粒转化菌。SDS分析其中可溶性GST-CBP融合蛋白的表达状况,找出最佳的诱导时间及条件。1.6结果表明，抗原性分析应用DNAStar软件的Protean软件对ORFV-JL毒株CBP基因的测序结果进行蛋白的抗原性方面的生物信息学分析。1.7western-blolting分析方法先同上进行SDS,然后将蛋白转移至己预先经过转移缓冲液浸泡过的硝酸纤维素膜,进行Western-blotting分析。一抗为GST-Tag小鼠单抗(1∶5000稀释),二抗为HRP标记的羊抗小鼠IgG(1∶5000稀释),经DAB显色后分析。2结果2.1pcr扩增产物的检测应用引物Pl和P2,以提取的病毒DNA为模板通过优化PCR反应条件,扩增得到产物,经电泳检测获得约506bp的扩增产物(图1),与预期扩增的DNA片段大小相符。2.2amh双酶切鉴定将提取的质粒进行PCR和EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定后,得到与原来大小相一致的片段。说明该片段已经成功连接到原核表达载体pGEX-4T-1上(图2)。2.3sds-东南角检测对不同IPTG诱导浓度及不同诱导时间的GST-CBP蛋白的表达进行SDS检测,以诱导浓度为0.5mmoL/L时表达量最大,其表达量以诱导5～6h达到最大,诱导时间即使延长,表达水平亦未见增加(图3、4)。2.4抗原性分析抗原指数分析结果显示,ORFV-JL分离株CBP基因编码蛋白的抗原决定簇相对较为集中,表明其具有良好的免疫原性。2.5estern-blctting检测用GST-Tag小鼠单抗对重组蛋白进行Western-blotting检测,结果显示,在49000处出现明显的特异性条带(图5),说明重组蛋白具有良好的免疫原性。3cpp基因的克隆及表达ORFV编码的CBP是对宿主有致病性的毒力因子和免疫调节作用的细胞因子,它主要通过与一些免疫调节因子结合并降低其活性,进而干扰和/或破坏宿主的免疫反应,阻碍获得性免疫的产生,导致机体的免疫力下降,从而对宿主产生致病性。CBP与C-和CC-趋化因子有高度的亲和性,它能与趋化因子表面的受体结合位点上的氨基酸残基结合,并且CBP能抑制皮肤炎性细胞的再生。CBP通过表面的细胞质基因组的共振与炎症反应相关的CCL2、CCL3和CCL5趋化因子产生高度亲和力,能完全的抑制单核细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞向感染部位集聚。此外,还能与C-趋化因子中的淋巴细胞趋化因子(能表达淋巴细胞趋化因子受体XCR1的T细胞、嗜中性粒细胞和B细胞)相结合发挥作用。因此,CBP作为一种重要的免疫调节因子在揭示ORFV分子致病机制的过程中起到重要作用。鉴于此,本试验选取CBP作为靶蛋白进行研究,通过对ORFV-JL分离株的CBP基因进行PCR扩增,克隆入原核表达载体pGEX-4T-1中进行表达;经SDS检测,已成功表达了该目的蛋白,为从该靶蛋白入手进行病毒的复制过程、侵入途径、致病机制等方面的研究提供了物质基础。目前,pGEX作为一种方便且高效的原核表达系统被广泛使用,它具有纯化条件温和、步骤简单,以及纯化后蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性的特点,具有较好的应用价值,在IPTG的诱导下能表达出由GST为前导序列的融合蛋白,且所表达出的融合蛋白大多是可溶的,极大的方便了目的蛋白的纯化。因此,本试验通过对表达条件的优化,IPTG诱导浓度为0.5mmoL/L,诱导表达后5～6h其表达量达到最大,成功利用pGEX-4T-1原核表达载体实现了CBP的可溶性表达。之后运用生物信息学软件对蛋白序列进行抗原指数分析,发现该蛋白的抗原决定簇较为集中,说明该蛋白具有良好的抗原性;之后又用GST-Tag小鼠单抗进行GST-CBP融合蛋白的We