rp-hplc法测定护肝片中五味子甲素和五味子乙素的含量

rp-hplc法测定护肝片中五味子甲素和五味子乙素的含量

肝保护片由五味子、猪胆脂粉等五种中药组成。经过加工的片剂具有平肝理气、健脾消食、降血酶的功效。慢性肝炎和早期肝硬化患者，可被收录在中国药典（2000年版，一部分）。药典中样品经索氏提取后,用反相高效液相色谱法测定护肝片中五味子乙素的含量,作为控制该药质量的指标。但我们考虑到其主要有效成分为五味子甲素和五味子乙素,故同时测定护肝片中五味子甲素和五味子乙素2种成分的含量来控制其质量,并且比较了各种提取方法对样品提取率的影响,为新版中国药典的编纂提供了有利的实验依据。1超声波清洗器、药品检定所和药物试剂Waters高效液相色谱仪(美国):510泵,2487紫外检测器;浙江大学色谱工作站;TCQ-250超声波清洗器(北京医疗设备二厂)。五味子甲素和五味子乙素对照品(购自中国药品生物制品检定所,批号0764-200006和765-200104);乙腈(色谱纯,美国迪马公司);其它试剂均为分析纯。护肝片(黑龙江省五常葵花药业有限公司,批号200210104)。2方法和结果2.1流动相、检测波长色谱柱:迪马公司Diam0nsilTMC18分析柱(250mm×4.6mm,5μm);流动相:乙腈-水-冰醋酸(70:30:0.1);流速:1.0mL·min-1;检测波长:254nm;灵敏度0.5AUFS。2.2样品的提取方法本实验曾比较正己烷、甲醇、75%乙醇超声以及正己烷索氏提取(2000年版药典采用)的方法对护肝片进行提取,发现护肝片中五味子甲素和五味子乙素用甲醇提取率最高,故选用甲醇超声法来提取样品。2.3甲醇的用量取护肝片20片除去糖衣,精密称定,研细,取0.25g,精密称定,置50mL具塞三角瓶中,精密加入甲醇25mL,称重,超声20min,放冷,再称重,用甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,弃去初滤液,取续滤液5mL置10mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得。2.4准分离主溶液的制备按护肝片的处方制备不含五味子药材的阴性对照,照供试品溶液的制备项下同法操作,即得。2.5对照品溶液的制备分别取五味子甲素和五味子乙素对照品适量,加甲醇配制成五味子甲素(0.10mg·mL-1)和五味子乙素(0.16mg·mL-1)对照品混合溶液。精密量取上述溶液0.5mL,置25mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液。2.7方法研究2.7.1标准曲线的绘制取五味子甲素约1mg和五味子乙素约2.4mg,精密称定,置10mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品贮备液。精密量取该贮备液1mL,置10mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度。精密吸取该溶液2,4,6,8,10,12μL,按上述色谱条件依法进样,测定峰面积。以相应的峰面积Y为纵坐标,进样量X(μg)为横坐标绘制标准曲线。五味子甲素和五味子乙素的回归方程(n=6)分别为:五味子甲素和五味子乙素进样量分别在0.02～0.12μg和0.048～0.288μg范围内与峰面积有良好的线性关系.2.7.2检测最低限额在信噪比S/N≥3时,五味子甲素和五味子乙素的最低检测限分别为0.291ng和0.806ng。2.7.3药液法测定配方取同一护肝片样品5份,按照供试品溶液的制备项下同法操作制备溶液,注入液相色谱仪,依法测定,五味子甲素和五味子乙素峰面积积分值的RSD分别为0.71%和1.8%。由此可见该法重复性良好。2.7.4味子甲素和药代动力学取护肝片,按“2.3”项下同法操作制备供试品溶液,取该溶液,重复进样5次,测定峰面积,五味子甲素和五味子乙素峰面积的RSD分别为1.7%和0.87%。2.7.5溶液稳定性试验取护肝片约0.25g,按“2.3”项下同法操作制备供试品溶液,分别于0,1,2,3,4,5,6,7,8h进样,测定峰面积,结果显示供试品溶液在8h内稳定。2.7.6药料的回收率和精密度分别取已知含量的护肝片细粉5份,每份约0.125g,精密称定,分别加入五味子甲素40.54μg、,五味子乙素92.54μg,使与0.25g样品所含五味子甲素和五味子乙素的量相当,依法制备所需溶液,进样测定。结果五味子甲素、五味子乙素平均回收率分别为97.25%,97.07%;RSD分别为2.6%,1.9%。结果表明,方法的准确度高,精密度好,方法可行。2.8护肝片中药代动力学含量的测定分别取护肝片各3份,每份约0.25g,精密称定,分别按本文方法和中国药典(2000年版)方法制备供试品溶液,注入液相色谱仪,然后计算含量。按本法测得护肝片中五味子甲素和五味子乙素的平均含量分别为326.3μg·g-1和741.5μg·g-1。按中国药典方法测得护肝片中五味子甲素和五味子乙素的平均含量分别为237.2μg·g-1和521.5μg·g-1。由此可见,用甲醇直接超声对样品进行提取,更能反映药品的质量。3药品含量测定3.1五味子中主要化学成分为含多种木质素类化合物,其中五味子甲素和五味子乙素为主要有效成分,因此同时测定护肝片中五味子甲素和五味子乙素的含量,对更好地控制护肝片的内在质量具有重要意义。3.2经过多次试验比较,发现采用甲醇超声的方法来提取同一批样品测得的含量(五味子甲素和五味子乙素的平均含量分别为326.3μg·g-1和741.5μg·-1)均大于中国药典(2000年版)的索氏提取法(五g味子甲素和五味子乙素的平均含量分别为237.2μg·g-1和521.5μg·g-1),加之索氏提取操作费时、费溶剂、步骤比较烦琐,故选择甲醇直接超声的办法来处理样品,能更好的反映药品本身的质量。3.3在流动相的选择上,我们曾采用药典中的流动相即甲醇-水(72:28),发现五味子乙素与其前面的杂质峰不能得到良好分离,参考有关文献我们选用了乙腈-水(70:30)为流动相,五味子甲素和五味子乙素均能与其它杂质峰分离良好,当在流动相中加入0.1%的冰醋酸后又能很好地改善峰形,故最后选择乙腈-水-冰醋酸(70:30:0.1)。3.4本文无论是在含量指标的控制,还是在有效成分的提取和流动相的选择上,均可为新版药典收载护肝片的含量测定方法提供有利的实验依据。分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液,注入液相色谱仪,记录色谱图,结果见图1。从图中可见,五味子甲素和五