2,5i-寡核苷酸-长循环脂质体的制备及质量评价

2,5i-寡核苷酸-长循环脂质体的制备及质量评价

bcl-2基因是一种遗传因素，能抑制细胞的死亡，对肿瘤和善恶有很高的治疗效果。因此bcl-2基因是理想的的反义治疗靶点。由于反义寡核苷酸(ASON)在体内易被核酸酶降解,稳定性差,因此常需借助于载体系统。基因治疗载体有生物载体和非生物载体。生物载体如病毒等,因安全性问题,应用受到限制。非生物载体,特别是长循环脂质体(LCL),具有安全可靠、容易制备、延长ASON循环时间,提高转染效率等优点。本研究采用改进的逆相蒸发法制备125I-ON-LCL,并评价其质量作为进一步研究125I-ASON-LCL治疗bcl-2基因高表达恶性肿瘤的的实验基础。1材料和方法1.1仪器、试药与仪器R201型旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司),SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司),水浴超生仪(上海新艺生物技术研究所),SorvallPro80型超速离心机(美国科峻仪器公司),H-600型透射电子显微镜(日本Hitachi),ZS90型激光粒度仪(英国Malvernmastersizer),UV-2100分光光度计(美国Beckman公司),LiposoFastTM挤压仪(美国Avestininc),FH463A-自动定标器(北京仪器厂),透析袋(德国Visking),SA-2128型分布收集器(美国Biorad)。1.2大豆淀粉、胆固醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000)和二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)(美国Shearwater公司),大豆卵磷脂(上海太伟药业有限公司),胆固醇(广州南方化玻公司进口分装),三氯化铊(TlCl3美国Sigma),SephadexG25(美国Sigma),SephadexG50(北京拜尔迪生物公司),Na125I(成都中核高通同位素股份有限公司)。其他试剂均为国产分析纯。1.3方法1.3.1硫代修饰碱基的表征包括针对bcl-2mRNA蛋白编码区的ASON以及作为对照的SON和NON的序列分别为5′-ASASTSCCTCCCCCAGTTCACS-CSCS-3′、5′-GSGSGSTGAACTGGGGGAGGASTS-TS-3′和5′-TSCSCSCACCTCACCTACCATSCS-GS-3′(s表示硫代修饰的碱基)。以上均由上海生物工程技术服务有限公司设计合成。1.3.2-苯基-5-硫酸钠的合成取适量ON于60℃加热10min,加入碘化钾、Na125I和TlCl3(pH=5),再于70℃加热20min,然后加入亚硫酸钠并于冰浴中终止反应。用1mol/L乙酸铵和0.5mol/L氨水的混合物将反应混合物的pH值调至8.5。用纸层析法按下式测定125I-ON的比移值(Rf)和标记率:Rf=待测组分和原点的距离/流动相前缘和原点的距离;标记率(%)=层析斑点对应的放射性峰的cpm/整个纸条总cpm。1.3.3放射性分布的测定用0.01mol/LHEPES(pH=7.4)为洗脱液,将125I-ON反应混合液经SephadexG25柱(ue07e0.5cm×50cm)分离纯化,分部收集器收集滤液,每管15滴,用自动定标器测定125I-ON的放射性分布。UV-2100分光光度计测定ON浓度(1OD=33μg/ml)。收集第一个放射峰,按下式计算其放化纯和比活度:放化纯(%)=层析斑点对应的放射性峰的cpm/整个纸条总cpm;比活度(MBq/μg)=放射性浓度(MBq/ml)/ON质量浓度(μg/ml)。1.3.4i-完成的稳定性用纸层析法分别测定在37℃条件下125I-ON在0.01mol/LHEPES洗脱液(pH=7.4)和人血清中于1h、2h、4h时的放化纯,以观察其稳定性。1.41逆相蒸发法制备项目将大豆卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000和DPPG以0.50∶0.35∶0.03∶0.10的摩尔比精密量取后,采用逆相蒸发法制备125I-ON-LCL。分别经400nm、200nm和100nm聚碳酸脂膜挤压后,对125I-ON-LCL进行质量评价。1.4.1形态观察取125I-ON-LCL液少许,经10g/L磷钨酸染色后,用透射电子显微镜观察其形态并拍照。1.4.2粒径和聚分散指数取样品适量,用0.01mol/LHEPES缓冲液稀释至0.1mg/ml,激光粒度仪测定125I-ON-LCL的粒径、聚分散指数(PDI)和Zeta电位。1.4.3弹性计数a的测定采用三种方法分离125I-ON和125I-ON-LCL,选择分离效果最佳者测定包封率。①层析柱分离法:采用SephadexG50装柱(1.5cm×21cm),用0.01mol/LHEPES缓冲液为流动相,上样0.5ml,洗脱速度约为1ml/min,用分部收集器接收滤液(2ml/管×30管),并用自动定标器测定层析前125I-ON的放射性计数(A0)和层析后第一个放射性高峰的放射性计数(A1)。②透析法:取适量125I-ON-LCL和125I-ON,先分别测定其放射性(A0),然后加入一定长度的透析袋内,两端用夹子固定,放在盛有0.01mol/LHEPES透析介质的烧杯中。将此烧杯置于定时恒温磁力搅拌器上搅拌24h后,测量透析袋内的放射性(A1)。③超速离心法:取适量125I-ON-LCL和125I-ON(作为对照),测定其放射性(A0),然后在6×104r/min,离心力3.74×105×g离心8h,测定管底的放射性(A1)。包封率=A1/A0。2结果2.1125.测量量、rf值、放化纯度和比活度ON的125I标记共重复8次,结果见表1。2.2125.coor的稳态观察测定125I-ON在0.01mol/LHEPES洗脱液(pH=7.4)和人血清中的放化纯(%)共重复5次,结果见表2和表3。2.3125.1质量分析2.3.1125i-tocll的形状I-ON-LCL的形态见附图,图中可见圆形或椭圆形的脂质体,大多为单室脂质体,还可见到其双分子结构。2.3.2125-lcl的粒径分布和zeta-l的水位I-ON-LCL的平均粒径(115±8.5)nm,PDI=0.103±0.01,Zeta电位为-29.23mV。2.3.3征收率。125i-lcl密封率的测量2.3.3.lcl和点气干的分离经SephadexG50柱分离后,125I-ON-LCL和125I-ON的放射性高峰均在12ml左右出现,10～20ml左右洗脱完毕,说明该方法无法有效分离二者,不能用于125I-ON-LCL包封率的测定。2.3.3.透析袋内放射性计数n-lcl透析24h后,125I-ON和125I-ON-LCL在透析袋内外放射性计数基本相同,说明ON的相对分子质量较大,无法通过透析袋,亦不能用于125I-ON-LCL包封率的测定。2.3.3.cpm比本底32cpm略高I-ON超速离心后,离心管底的放射性(805±66)cpm比本底432cpm略高;而125I-ON-LCL离心管底可见乳白色沉淀物,总的放射性A0和离心管底的放射性A1见表4。3阴离子-lcl包封的药物基础DNA的放射性碘标记受很多因素的影响,如氧化剂的选择、反应体积、pH值、反应时间和温度等。由于TlCl3是一种比较温和的氧化剂,在加热和酸性条件下进行亲碘取代反应,其标记率高,对ON的生物活性影响小,而且125I-ON比活度高。在制备125I-ON时,主要的放射性杂质是游离的125I-,由于ON的相对分子质量和碘的差别很大,故SephadexG25凝胶柱可以很好地分离二者。本试验中125I-ON放化纯和比活度分别大于98%和0.60MBq/μg。而且在4h时,125I-ON在0.01mol/LHEPES洗脱液中仍可稳定存在(放化纯>93%)。虽然125I-ON在人血清中有脱碘现象(可能与脱碘酶的作用有关),但是4h时125I-ON放化纯均大于80%。以上结果均提示这种标记方法制备的125I-ON能满足体内外研究的需要。LCL是目前较为理想的反义治疗载体之一,能保护ASON免遭核酸酶的降解,提高其转染效率,在动物反义治疗模型的研究中,已取得可喜的进展。将治疗用放射性核素标记的ASON包封于LCL内,可望同时达到反义治疗和内照射治疗的目的。但是125I-ASON作为一种特殊的药物,必须具有足够的生物活性、稳定性,而且必须进入细胞内才能发挥治疗作用。含有磷脂酰丝氨酸的阴离子脂质体,可将ASON包裹于水相内,通过内吞方式而进入细胞内,因此经其转运的ASON主要存在于细胞核中。有研究发现,人卵巢癌细胞对阴离子脂质体介导的寡聚核苷酸的摄取量增加7～18倍,在细胞内,寡聚核苷酸也容易从脂质体中释放出来。Zeta电位是微粒表面荷电大小的标志,是影响微粒分散药物制剂行为的重要参数。当Zeta电位小于-30mV时,荷电粒子相当稳定。本实验通过在脂质体膜中掺入带负电荷的DPPG制备阴离子LCL,其Zeta电位为-29.23mV,提示其体内外稳定好。目前尚未见关于阴离子-LCL包裹ON的报道。脂质体粒径的大小对其体内行为有着重要的影响:在静脉注射后,粒径<100nm的脂质体容易进入骨髓;2.5～10μm脂质体容易被RES细胞识别和吞噬,很难到达病灶部位。容易透过毛细血管被肿瘤摄取的最佳的脂质体粒径范围大约在100～200nm。粒径为100nm的LCL,能在血液循环中保持相当长一段时间。虽大部分LCL不能渗透正常组织完整的毛细血管,但却能从肿瘤毛细血管渗漏出来,并在肿瘤间隙存留达1周,因此LCL在肿瘤内形成药物储库,使之缓慢持续释放药物。而且粒径为100nm和157nm的阿霉素-LCL,对鼠乳腺癌的治疗作用明显优于255nm的阿霉素-LCL。与上述学者报道一致,本实验制备的125I-ON-LCL的平均粒径为115nm,分布均匀,提示125I-ASON-LCL可能较容易在bcl-2高表达的肿瘤内浓集。测定药物包封率的方法有葡聚糖凝胶柱分离、透析和超速离心等。葡聚糖凝胶柱分离为一种经典的测定包封率的方法。但是该方法和透析法均无法有效分离125I-ON-LCL和125I-