护肝宁片质量标准提升研究

护肝宁片质量标准提升研究

药品标准13号（标准号ws3-b-2520-97）。由垂盆草、虎杖、丹参、灵芝4味药组成。功能主治为清热利湿,益肝化瘀,舒肝止痛;退黄,降低谷丙转氨酶。用于急性肝炎及慢性肝炎。现行部颁标准无理化鉴别,无含量测定项;为了对该产品进行深入研究,为我公司今后开发肝病类系列中药打下基础,我公司组织科研人员对护肝宁片的质量标准进行了研究,在原标准基础上,我们增加了鉴别和含量测定项的内容,使原有的质量标准得到提升和完善。1检测方法及色谱Agilent1100series四元泵,带自动进样器,VWD检测器,AgilentHPChem色谱工作站。乙腈为色谱纯。色谱柱:迪马公司C18柱(250mm×4.6mm5μm),柱温:30℃。薄层层析板:硅胶G,高效硅胶G,青岛海洋化工厂。2药品对照品虎杖苷对照品由中国药品生物制品检定所提供。批号:111575-200301。丹参对照药材(120923-200006),大黄素对照品(批号110756-200110)由中国药品生物制品检定所提供。所用试剂皆为分析纯。样品及缺有关药味的阴性对照均由上海静安制药有限公司技术开发部提供。3定性分析3.1对照药材溶液取本品5片,去包衣,研细,加水20mL超声15min,离心5min,取上清液加NaOH试液调pH到7～8之间,用经水饱和的正丁醇萃取2次,每次20mL,弃去正丁醇层。水层加0.6mol/L的盐酸调pH至3,通过D101大孔树脂柱(直径1.5cm,柱高3.5cm),用水50mL洗脱,弃去,再用50%乙醇50mL洗脱,收集此洗脱液,蒸干,残渣加甲醇2mL溶解,作为供试品溶液。另取丹参对照药材1g加甲醇50mL超声30min,过滤,滤液蒸干,残渣加水5mL溶解,通过D101大孔树脂柱(直径1.5cm,柱高7cm),加水100mL洗脱弃去,再加20%乙醇100mL洗脱,收集此洗脱液,蒸干,残渣加甲醇2mL溶解作为丹参对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年一部附录VIB)试验,吸取上述溶液各10μL点于同一高效硅胶G板上,以醋酸乙酯-环己烷-甲醇-甲酸(7∶1∶1∶1)为展开剂,展开,取出,热风吹5min,喷以2%三氯化铁乙醇溶液。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的主斑点。3.2供试品溶液与薄层色谱法取本品1片,去包衣,研细,加水20mL溶解,用醋酸乙酯20mL萃取1次,分取醋酸乙酯层,蒸干,残渣加甲醇2mL使溶解作为供试品溶液。取大黄素对照品适量加甲醇溶解配制成每1mL含0.5mg的对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年一部附录VIB)试验,吸取上述溶液各10μL点于同一硅胶G板上,以石油醚(60～90℃)-醋酸乙酯-乙酸(12∶2∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,置氨蒸气中熏至斑点清晰。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。4定量分析4.1流动相组织化钠lmf用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,柱温为30℃,以0.01mol/L磷酸二氢钾(三乙胺调节pH值至6.8)—乙腈(83∶17)为流动相,流速为1.0mL/min,检测波长为320nm,理论塔板数按虎杖苷峰计算应不低于5000。4.2对照溶液的制备精密称取虎杖苷对照品适量,加稀乙醇制成每1mL含30μg的溶液,即得。4.3稀乙醇法氧化法取本品20片,精密称定,除去包衣,研细,精密称取0.12g,置100mL锥瓶中,精密加入稀乙醇50mL,超声处理30min,放冷,再称定重量,加稀乙醇补足重量,摇匀,取上清液用微孔滤膜(0.45μm)滤过,即得。4.4测量法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪测定,即得。4.5空白制剂的制备原方去虎杖药材,按制剂工艺法制备得缺虎杖的空白制剂。取空白制剂粉末0.12g,精密称定,以下同供试品溶液制备法,得空白制剂供试品溶液。按含量测定法分析,空白样品色谱在虎杖苷相应保留时间上没有干扰峰。说明虎杖药材中含有虎杖苷,在建立的色谱条件下测定虎杖苷无干扰,本方法准确、可行(见图1)。4.6标准曲线的绘制虎杖苷的标准曲线绘制:精密称取虎杖苷对照品15.12mg,置50mL量瓶中,用稀乙醇溶解,并稀释至刻度,摇匀,即得贮备液(302.4μg/mL)。采用逐级稀释法再分别配成浓度分别为302.4,151.2,30.24,6.048,3.024μg/mL的系列标准液,各进样10μL,在上述色谱条件下测定。以峰面积为纵坐标(Y),虎杖苷浓度为横坐标(X),绘制标准曲线,得回归方程:Y=37.8X-48.5;R=0.99986。虎杖苷进样量在3.024～302.4μg/mL之间呈良好的线性关系。4.7精密度测试取线性项下浓度为29.86μg/mL的溶液每次进样10μL,连续进样6次,记录峰面积,计算精密度。RSD为0.23%,符合要求。4.8样品溶液的稳定性试验同一样品供试液,隔2h测1次,共测7次,结果表明,供试液中虎杖苷在12h内稳定,RSD为0.06%。4.9相对标准偏差按前述的液相条件,对同一批样品进行6次平行测定(即n=6),计算相对标准偏差(RSD)平均含量12.61mg/g,RSD为0.86%。结果表明,含量测定方法具有良好重现性。4.10加样回收率测定精密称取本品各0.06g共6份,每份分别加入虎杖苷对照液(0.2986mg/mL)2.5mL。依法测定,并计算虎杖苷平均回收率为96.14%,RSD=1.08%。结果见表1。4.11样品测定3批号(批号050801050802050803)制剂样品,如法测定。样品测定结果见表2。5提取方法的确定5.1实验中曾尝试进行灵芝和垂盆草的鉴别,灵芝含三萜类化合物等成分,我们针对此进行了研究。样品分别加甲醇和水两种溶剂超声提取,过滤,滤液蒸干,加水溶解分别用氯仿和醋酸乙酯萃取,取萃取层蒸干,加甲醇溶解即可作为供试品溶液。取灵芝对照药材同法进行操作作为对照药材溶液。与对照药材相比,供试品溶液的斑点不明显,难于观察。垂盆草含垂盆草苷和异鼠李素等黄酮成分,我们针对此进行了研究。样品经丙酮冷浸和水回流两种方法提取,经正丁醇萃取,蒸干,点板后没有发现显著的斑点。灵芝和垂盆草的鉴别有待进一步摸索。5.2含量测定实验中考察乙腈-水、三乙胺-磷酸-乙腈、磷酸二氢钾-乙腈等多种流动相。试验结果表明,用磷酸二氢钾-乙腈体系可明显改善峰形及分离度。使用流动相0.01M磷酸二氢钾(三乙胺调节pH值至6.8)-乙腈(83∶17),虎杖苷色谱峰峰形良好,与杂质达到基线分离,分离度大于3.0,拖尾因子1.03,以虎杖苷计算柱效,其理论塔板数在5000以上。5.3含量测定实验中对提取方法进行考察,结果显示,超声提取与回流提取比较,两者的提取率相当,说明超声提取已能提取完全。对提取溶剂考察,分别精密加入稀乙醇、水、纯乙醇、70%乙醇、30%乙醇提取,结果显示,稀乙醇提取率较高。对虎杖苷提取溶剂加入量进行进一步考察。一份精密加入稀乙醇50mL,另一份则精密加入稀乙醇100mL,比较两者虎杖苷提取率。结果显示,用50mL溶剂已能提取完全。因此,选择虎杖苷的提取溶剂为稀乙醇50mL。提取时间考察,超声处理20,30,40,60min,结果显