川北医学院硕士研究生学位论文开题报告表(2012版)

川北医学院硕士研究生学位论文开题报告表（2012版）论文题目FTY720对EAE小鼠NO/NOS、MMP-9的mRNA及蛋白表达影响研究生姓名谭书伟学号201102033导师姓名余巨明年级2011级攻读学科专业神经病学所属院系临床医学系2013年6月15日学位论文开题报告内容的基本要点1.所选课题目前的国内外研究动态、水平；2.该领域内存在和亟待解决的问题；3.所选课题的目的、意义；4.预期达到的结果、安排；5.进行该课题所具备的条件；6.经费预算；7.进行该课题的难点及其解决方法。一、立论依据（包括研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处。）对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述本课题的科学意义；对应用基础研究着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题论述其应用情景。多发性硬化(MS)是中枢神经系统一种广泛脱髓鞘性自身免疫性疾病，可能是遗传易感个体与环境因素作用而发生的自身免疫过程，由于其发病率较高,呈慢性病程和受累人群以中、青年居多,而且导致严重的功能残障，而成为最重要的神经系统疾病之一。目前其病因和发病机制不清楚,治疗手段也有限。因此，深入研究其发病机制及开拓新的治疗方法，具有重要的临床意义.近年来，用MOG诱导EAE已经成为国际上研究MS的主要模型[1]。目前研究认为MS发病与病毒感染、免疫失调、遗传以及环境等多因素相关。本研究主要从免疫失调的角度剖析多发性硬化可能的发病机制，这是目前研究最多的。大多数学者认为，MS主要是由T细胞介导引起髓鞘、少突胶质细胞、轴索的特异性损伤。遗传与环境因素使得自身免疫性T细胞及抗体更容易通过血脑屏障进入中枢神经系统。对s1p1(鞘氨醇1—磷酸盐)受体研究发现，s1p1与T淋巴细胞迁移有很大关系[2]。FTY720是类似于s1p1的模拟体。从冬虫夏草中提取，2010年经FDA认证，FTY720正式成为一种治疗MS（主要是针对复发缓解型)的口服药物[3]。FTY720本身并不被s1p1s识别，在体内被神经鞘氨醇激酶磷酸化为FTY720-p后,与淋巴细胞表面的s1p1s结合，使s1p1受体内化和不敏感，从而抑制了T淋巴细胞从淋巴结迁移到外周组织中去,使中枢神经系统髓鞘不受T淋巴细胞的攻击[4]。近年来研究发现FTY720治疗MS除了通过淋巴细胞上的s1p1途径，中枢神经系统的星型胶质细胞S1P1也起了关键作用[5]。S1P1在中枢神经系统的神经元和神经胶质细胞（主要是星形胶质细胞）表达。研究者通过基因工程技术将表达S1P1的基因从所有中枢神经细胞组，神经元细胞组和星型胶质细胞组上分别敲除，用FTY720进行干预，几组中外周淋巴细胞变化水平并没有什么区别。如果FTY720只通过了淋巴细胞途径，那么在S1P1基因缺失的所有EAE小鼠中症状都应缓解。然而，实验中并没有观察到这一现象。只在S1P1基因缺失的神经元组中临床症状明显缓解，而在S1P1基因缺失的星型胶质细胞组没有缓解，说明FTY720对MS的治疗作用必须通过星形胶质细胞S1P1受体途径。Steinman等学者通过对MS大规模蛋白质组学分析发现，中枢神经系统多发性硬化损伤依据疾病的活动水平呈现不同的特点。研究者应用激光捕获显微切割和质谱分析法发现慢性活动性损伤（CAP）中5种参与凝血级联反应的蛋白[6]。这证实了凝血因子在多发性硬化免疫系统失调中具有不容置疑的作用。研究者将注意力集中在了其中的2种蛋白：凝血激酶和蛋白C抑制剂(PCI)。研究者将实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)小鼠（EAE小鼠常用于多发性硬化造模）分成生理盐水组，水蛭素组和重组激活蛋白C(aPC)组，每天注射相同剂量。实验发现：治疗35d后，免疫细胞增殖力下降,脾细胞及淋巴结细胞释放细胞因子减少，中枢神经系统中炎症反应灶的数量也降低了。水蛭素组和aPC组都能有效减轻EAE症状，从而认为凝血因子参与了MS的发病。以上的研究表明s1p1在淋巴细胞和星形胶质细胞上表达，并起了关键作用，以前认为s1p1是鞘磷脂的第二信使衍生物，调节几种细胞骨架反应:包括增殖、迁移和细胞存活[7].2012年HideruObinata和TimothyHla学者在NIH上做了关于s1p的研究表明：s1p受体不同的亚型在人体内不同程度地表达(如免疫系统、心血管、神经系统等)。s1p受体5个亚型中S1P1是关注的焦点，S1P1作为主要受体在淋巴细胞，神经元和星形胶质细胞等上表达并广泛参与人体病理生理过程[8].其中发现S1P1信号传导通路参与了凝血过程[9]。FTY720必须通过星形胶质细胞S1P1对MS起作用。凝血酶抑制剂水蛭素通过凝血途径对MS起作用，而s1p1又参与了凝血途径，那么水蛭素是否通过调节s1p1受体起到治疗MS的作用，查阅国内外相关文献没有报道。因此，我们拟就“水蛭素对EAE模型星形胶质细胞S1P1受体的影响”进行研究。如果水蛭素能通过调节s1p1受体起到治疗MS的作用，那么就为水蛭素在治疗MS中的临床运用提供新的理论和实验依据。参考文献参考文献[1]StefanieK,SitaJ,MagdalenaT,etal.FundamentaldifferencesinthedynamicsofCNSlesiondevelopmentandcompositioninMP4-andMOGpeptide35?55?induced[2]CzelothN,BernhardtG,HofmannF,GenthH,FörsterR.Sphingosine-1-phosphatemediatesmigrationofmaturedendriticcells.JImmunol.2005;175:2960–2967.[3] ObinataH,HlaT.Sphingosine1-phosphateincoagulationandinflammation[J].SeminImmunopathol,2012,34(1):73-91.[4] O'BrienK,GranB,RostamiA.T-cellbasedimmunotherapyinexperimentalautoimmuneencephalomyelitisandmultiplesclerosis[J].Immunotherapy,2010,2(1):99-115.[5] ChoiJW,GardellSE,HerrDR,etal.FTY720(fingolimod)efficacyinananimalmodelofmultiplesclerosisrequiresastrocytesphingosine1-phosphatereceptor1(S1P1)modulation[J].ProcNatlAcadSciUSA,2011,108(2):751-756.[6] HanMH,HwangSI,RoyDB,etal.Proteomicanalysisofactivemultiplesclerosislesionsrevealstherapeutictargets[J].Nature,2008,451(7182):1076-1081.[7]SpiegelS，MilstienS.Exogenousandintracellularlygeneratedsphingosine1－phosphatecanregulatecellularprocessesbydivergentpathways［J］.BiochemSocTrans，2003，31(Pt6):1216－1219．[8] HlaT,VenkataramanK,MichaudJ.ThevascularS1Pgradient-cellularsourcesandbiologicalsignificance[J].BiochimBiophysActa,2008,1781(9):477-482.[9] TakeyaH,GabazzaEC,AokiS,etal.Synergisticeffectofsphingosine1-phosphateonthrombin-inducedtissuefactorexpressioninendothelialcells[J].Blood,2003,102(5):1693-1700.

二、研究方案1.研究目标、研究内容和拟解决的关键问题研究目标：研究重组水蛭素对EAE模型星形胶质细胞s1p1表达的影响情况。以探讨重组水蛭素是否通过了s1p1受体途径治疗EAE研究内容：1.通过免疫荧光双标的方式标记星形胶质细胞和s1p1受体2.同时测定s1p1受体的基因表达情况。拟解决的关键问题：FTY720必须通过星形胶质细胞S1P1对MS起作用。凝血酶抑制剂水蛭素通过凝血途径对MS起作用，而s1p1又参与了凝血途径，那么水蛭素是否通过调节s1p1受体起到治疗MS的作用，查阅国内外相关文献没有报道。因此，我们拟就“水蛭素对EAE模型星形胶质细胞S1P1受体的影响”进行研究。如果水蛭素能通过调节s1p1受体起到治疗MS的作用，那么就为水蛭素在治疗MS中的临床运用提供新的理论和实验依据。2.拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析1.研究对象分组：生理盐水干预组，重组水蛭素干预组，正常组2.建立EAE动物模型，3.脑组织组织取材及制备药物干预后取脑和脊髓标本做冰冻切片，进行免疫荧光双标；一部份置于液氮中保存，进行RT-PCR检测。4.脑组织是s1p1受体mRNA的检测取脑组织100mg匀浆，提取总RNA,采用荧光定量PCR检测脑组织s1p1受mRNA表达情况。可行性分析1.本课题立项是基于川北医学院具备基础研究的条件和设施。2.导师及指导老师在这方面具有扎实的理论基础和丰富的经验。3.方案实施和技术路线的确定是经过多方面查阅文献资料，并结合实际情况后得出,具有一定的科学性和可操作性。4.川北医学院统计学教研室师资力量雄厚，可以提供准确可靠的统计学帮助。雌性C57BL/6雌性C57BL/6小鼠正常组（不含MOG正常组（不含MOG的弗氏佐剂）水蛭素干预组（含MOG的弗氏佐剂)生理盐水干预组（含MOG的弗氏佐剂)技术路线12天后对12天后对EAE发病评分取脑和脊髓标本（发病后30天）进行免疫荧光双标进行免疫荧光双标RT-PCR测定s1p1RT-PCR测定s1p1受体基因表达GAFP标记星形胶质细胞GFP标记s1p1受体GAFP标记星形胶质细胞GFP标记s1p1受体3.本课题的创新之处本课题的创新之处是试图探讨：“水蛭素对EAE的治疗作用是否通过了星形胶质细胞s1p1受体途径”,从而为水蛭素等凝血酶抑制剂的临床应用开辟新的途径。4.研究计划及预测进展本研究预期共需1年，研究进度和目标安排如下：2013.1-2014.31.查阅资料及实验室试剂和器材的准备工作。2.建立EAE动物模型3.药物干预后取脑标本，到病理科行冰冻切片，然后免疫荧光双标4.测脑标本s1p1受体基因表达5.整理资料、撰写论文，结题。5.预期研究成果通过本研究如能发现重组水蛭素干预组s1p1受体表达较正常对照组明显增加。结论如与我们先前的动物实验一致，从而为水蛭素等凝血酶抑制剂对EAE治疗作用开辟新的临床途径。

本研究拟在国内外核心期刊上发表有关研究结果的论文1－2篇。三、研究基础1.与本课题有关的，前期研究工作积累和已取得的研究工作成绩。发表在NIH上的研究发现FTY720治疗MS除了通过淋巴细胞上的s1p1途径，中枢神经系统的星型胶质细胞S1P1也起了关键作用。S1P1在中枢神经系统的神经元和神经胶质细胞（主要是星形胶质细胞）表达。研究者通过基因工程技术将表达S1P1的基因从所有中枢神经细胞组，神经元细胞组和星型胶质细胞组上分别敲除，用FTY720进行干预，证明了FTY720对MS的治疗作用必须通过星形胶质细胞S1P1受体途径。发表在Nature上的一项研究通过对MS大规模蛋白质组学分析发现，中枢神经系统多发性硬化损伤依据疾病的活动水平呈现不同的特点。研究者应用激光捕获显微切割和质谱分析法发现慢性活动性损伤（CAP）中5种参与凝血级联反应的蛋白。用水蛭素干预能有效减轻EAE症状，从而认为凝血因子参与了MS的发病。2.已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径（包括利用其他实验室和开放实验室的计划与落实情况）。实验室设备及设备条件：本院的动物实验中心，风湿免疫研究所、病理科具有完善的设备。包括：电泳仪、凝胶成像系统、核酸蛋白定量仪、酶标分析仪、倒置显微镜、低温离心机、超净台、恒温培育箱、冰冻切片机、及CO2细胞培养箱等设备可供本项目研究使用。实验所需的各种药盒及试剂均能购买。本研究所依托的学校和医院具有丰富的馆藏文献和专业的中英文全文数据库，能提供及时全面的文献资料，保障实验的顺利进行。能成功建立EAE小鼠模型，熟练掌握了病理切片、RT-PCR、荧光双标等技术和方法。3.近期已发表与本课题有关的主要论著目录。序号作者题目发表或投稿刊1LawrenceSteinmanProteomicanalysisofactivemultipleNaturesclerosislesionsrevealstherapeutictargets2JiWoongChoiFTY720(fingolimod)efficacyinananima