超氧化物歧化酶的研究进展

超氧化物歧化酶的研究进展

氧化还原反应是生命最重要的代谢途径。它不仅能为生物提供能量，还决定着生命的衰老和死亡。氧对于生命活动极其重要,但氧参与的代谢经常产生一些对细胞有毒害作用的副产物———氧自由基,即通常所说的活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)。细胞产生的活性氧包括:超氧根阴离子(O2·-)、氢氧根离子(OH-)、羟自由基(·OH)、过氧化氢(H2O2)、单线态氧(·O2)和过氧化物自由基(ROO·)。它们都能通过氧化应激损伤细胞大分子,引起一系列有害的生化反应,造成蛋白质损伤、脂质过氧化、DNA突变和酶失活等。为了防止氧自由基对细胞体的破坏,几乎所有细胞都有一套完整的保护体系,来清除细胞新陈代谢产生的各种活性氧。其中,超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)在保护细胞免受氧自由基的毒害中发挥着重要作用。早在1969年,McCord和Fridovich发现了一种血球铜蛋白能清除自由基(O2·-),并且将这种血球铜蛋白命名为超氧化物歧化酶(SOD)。SOD几乎存在于所有生物细胞中,通过把O2·-转化为H2O2,H2O2再被过氧化氢酶和氧化物酶转化为无害的水(H2O),从而达到清除细胞内氧自由基,保护细胞的目的。超氧化物歧化酶的来源有很多种,动物、植物和微生物中都提取。其在食品、医药及农业方面表现出很大的应用潜力,本文从SOD来源和应用的角度综述了SOD的研究进展。1金属辅因子的价值流变SOD是一种重要的抗氧化剂,保护暴露于氧气中的细胞。其能够催化超氧化物通过歧化反应转化为氧气和过氧化氢主要通过以下两步完成:这里M代表金属辅因子,M3+代表金属辅因子的最高价,M2+代表金属辅因子被氧化以后的价位。这种逐步递增机制从反应动力学来说,具有如下优点:首先,一个分子反应能克服两个分子同时反应之间产生的静电排斥作用,且带正电荷的活性金属特异性结合带副电荷的超氧阴离子(O2·)。其次,活性位点的金属离子静电引力被一个质子吸收并保存,在这种机制中,歧化反应的产物是中性的,不互相约束。第三,第一步反应释放的能量能提供给第二步来还原超氧阴离子(O2·),然后H2O2再被过氧化氢酶还原成H2O。2sod分类及其生产方法2.1cu/zn-sod和fe-sodSOD时刻清除细胞内新陈代谢等过程中产生的氧自由基。所有SOD催化中心都包含有一个金属离子,根据金属离子的不同,SOD家族可以分为四种:Cu/Zn-SOD、Fe-SOD、Mn-SOD和NiSOD。在20亿年前,SOD在原核生物中出现两类:Cu/Zn-SOD和Fe/Mn-SOD。随着基因的进化,Fe/Mn-SOD逐渐演变为Fe-SOD和Mn-SOD,三维机构和氨基酸序列却依然非常接近。然而Cu/Zn-SOD和Fe-SOD,Mn-SOD在晶体结构和催化机制上都表现出非常大的差异,这也从侧面支持独立进化的假说。Cu/Zn-SOD主要存在于真核细胞质、叶绿体和细菌细胞质、周质空间中。在细菌、植物和动物中,Cu/Zn-SOD的编码基因不尽相同。Mn-SOD主要存在于原核生物和真核生物的线粒体中。Fe-SOD存在于原核生物和少数植物中。在原核生物和植物叶绿体中编码Fe-SOD的基因序列相似性很高。许多古生菌来源的Fe-SOD和Mn-SOD都极端耐热(很多最适生长温度超过40℃),推测它们起源于物种形成的早期。而且,这些极端嗜热SOD可以在很宽的温度范围(包括室温)内发挥催化活性。从生化角度分析,较高的Tm值以及宽泛的催化温度可以使这些酶以准冻结状态存在,在反应过程中无需较大的构象变化,而且很容易适应中温环境,并在中温环境下发挥活性。迄今为止,只在链霉菌属和蓝细菌中发现有Ni-SOD的存在,对Ni-SOD的研究也相对较少。杜邦公司利用公共数据库分析了它们的序列,发现这些Ni-SOD大多存在于海洋生物之中。2.2发酵生产过程中sod的提取目前SOD的生产方式主要有四种:①利用动物血液提取法,这是20世纪90年代以前最常用的方法。这种方法存在交叉感染和过敏性反应等风险,欧盟已于1999年颁布法令,禁止从动物血液中提取的SOD用于人类的医疗和保健。②从植物中提取。现已报道分别从大蒜、桑叶、沙棘、仙人掌、玉米和大豆中成功提取获得SOD。其提取方法主要有分步盐析法、有机溶剂沉淀法和层析法等。但植物中SOD含量较少,提取工艺相对复杂,这就使得SOD生产成本相对较高。③微生物发酵法生产SOD。选育SOD高产菌株进行发酵生产一种是比较有效的方法,1997年,王岁楼等利用常规筛选方法自然筛选出1株SOD高产菌株,酶活可达600U/g湿菌体,为SOD的工业化发酵生产打下了基础。吴思方等研究了从啤酒废酵母生产、提取和纯化SOD的方法及条件,得到比活为3048U/mg的SOD。微生物发酵技术生产SOD,不仅产量高,而且提取工艺简单,因而能大幅度降低SOD的生产成本。由于SOD来源有限,异体蛋白免疫原性,受温度和pH等影响不稳定性,在应用方面也会有很大限制。④基因工程法是获得应用所需要SOD产品有效途径。近年来,美国、日本、英国和德国相继开发了微生物基因工程产品,并进行了临床实验。施惠娟等分别以人胎肝组织及人肝细胞株(L02)总RNA为模板,以RT-PCR法获得hCu/Zn-SOD和hMn-SODcDNA,构建表达质粒pETSOD,并导入E.coil细胞中使之表达,分别获得了38%和50%的高表达率且有活性。目前,国内外在基因工程生产SOD方面均取得了可喜的成果。3超氧化物诱导酶的应用潜力3.1保持体内od含量的意义正常健康机体内自由基的形成和清除处于一种动态平衡中,但随着年龄的增长,体内SOD的含量呈下降趋势,相应的,增长的自由基会破坏机体的平衡,使机体产生各种疾病。所以,保持体内适量的SOD是维护健康和延缓衰老的有效途径。根据这一原理,作为自由基清除剂之一的SOD现已被用于临床治疗研究,并取得一定的效果(表1)。3.2关于sod的应用SOD在食品工业上的应用一直存在争论,主要有两方面的疑问:一是SOD作为生物大分子如何通过细胞屏障进入到人体内;二是SOD化学本质为蛋白质,通过口服流经肠胃时会不会被蛋白酶类降解和破坏。Marinv和Pastori利用口服SOD治疗睾丸变性,结果表明服用SOD的90名患者均疼痛感消失,且大部分人的性功能有所恢复。Bernier等对小鼠口服SOD治疗局部缺血再灌注引起的心室纤维性颤动进行了研究,发现口服SOD后,纤维性颤动的发生率由对照组的87%降到27%。这两个实验能间接的证明,SOD口服能起到一定的作用。但要从科学的角度来解决上述两个问题,得通过相应的实验来证明。关于第一个观点,现在还没有科学的论断,部分学者认为,口服SOD后,SOD在胃肠道降解成小分子进入血液循环,因为通过荧光标记实验,可以在血液中检测出来。另一方面,SOD降解后的一些小肽段能穿过细胞膜,也许这些小肽段也有部分的SOD活性。关于第二个观点,胃酸pH在1~2.5左右,SOD经灌胃后能够耐受胃肠道中酸解和酶解作用,有50%左右的SOD以活性形式存留下来,为SOD的吸收提供了前提条件。SOD在食品中应用相对于医药应用来说比较简单,之前SOD不能大规模应用于食品工业,可能在于不同来源的SOD本身稳定性的差异。从动物、植物或者一般的微生物里提取出来的SOD稳定性较差,不能耐高温和酸。要想把各种来源的SOD做成食品,需要对SOD本身及载体进行改造,例如,口服SOD的时候同时服用酶抑制剂,应用膜透过促进剂,脂质体和微囊包埋等。另一方面,也可以从SOD的来源着手,中国科学院微生物所从极端环境中筛选到一种产耐热SOD的菌株,该SOD能耐高温,耐酸耐碱,稳定性强,在食品工业中可以有很好的突破。3.3植物抗氧化活性SOD与植物生物和非生物胁迫抗性有很重要的关系。通过对水稻、狭叶羽扇豆、烟草等的研究结果看,在盐害环境下SOD活性升高。国外对小麦斑点病、黄瓜霜霉病、棉花黄萎病等也进行了研究,结果显示,凡感染病害的植株体内SOD活性都有所增强。光调节的发育过程包括发芽、茎的生长、叶和根的发育、向光性、叶绿素的合成、分枝及花的诱导等。在对红树林的研究中发现,3d的暗培养并没有使SOD的表达量发生变化,而7d暗培养后SODmRNA表达量明显下降。无论SOD活性升高或是降低、表达量增加还是减少,都会发现活性高的与表达量高的株系抗性较强。SOD的表达量高低与活性的强弱都直接决定了植物的抗逆性。SOD在植物基因工程中的应用广泛受到科研工作者的关注和重视,试图通过转SOD基因技术来培育高抗逆农作物新品种已成为国内外研究热点之一。2002年克隆出了桃的MnSOD基因。2006年希腊克隆出了棉花的Cu/ZnSOD基因。我国也克隆出了水稻的FeSOD基因,并且原核表达出了有活性的蛋白。这些研究都为利用培育高抗性的转基因植物提供了坚实的基础。4加入sod的生物生态学特性SOD已在食品、医药保健品以及农业上展现了巨大的功能价值,特别是在当前地球环境日益恶化的情况下,各种来源的食品、饮用水等都因为环境污染和恶化,造成大量氧自由基的产生,而这种失衡的过量氧自由基对人体健康会产生一系列影响,会间接性诱发各种癌症、炎症和糖尿病等的高发,因此,通过在食品中加入适量SOD,或补充食入适量的SOD,可以有效调节和降低食品中及机体中过量的氧自由基的积累,从而能够有效保护人体细胞不受到过量氧自由基的破坏,延缓细胞的衰老过程,最终使人的生命得到健康延寿。目前国内外大量临床实验证明口服SOD也能够在机体中发挥SOD抗衰老和抗病治疗的作用,同位素示踪实验表明,人体可能通过一些特殊的消化吸收机制,使得一定量的具有SOD进入人体中,发挥其功能,但这类吸收机制的原理还有待