猪、鸡及乳制品中乳酸菌的分离及耐胆盐性能研究

猪、鸡及乳制品中乳酸菌的分离及耐胆盐性能研究

蘑菇是动物身体的正常生理菌之一。如果在肠道内繁殖达到一定数量，它将改善和调节主体内微生物菌群的平衡，对主卫生起到有益的作用。ch。促进动物对营养物质吸收、增强动物机体免疫力、抑制有害细菌生长等作用［２］。乳酸菌不但赋予发酵食品特有的风味,还具有一定的益生功能。Metchnikoff在1908年首次提出摄食发酵食品对人体具有保健功能,而发酵食品的保健功能得益于其中的微生物,现已明确发酵食品中的乳酸菌对人体具有多种保健功能,如提高机体免疫力［３］。乳酸菌等益生菌能否发挥作用,取决于菌株能否通过胃肠道的酸性环境以活菌的状态到达小肠,从而发挥微生态的益生功能［４］。因此,筛选能够进入肠道、具有高生存性的乳酸菌,是益生菌开发首要考虑的问题。内蒙古作为我国的传统牧区,乳制品是当地牧民的主要食物来源。传统的乳制品加工方法经过数百年的优化,筛选,较好地保存了当地自然环境中的有益乳酸菌,是天然的乳酸菌贮存库［５］。本试验从内蒙古阿拉善牧户家中采集的酸奶及酸驼乳样品以及呼和浩特某养猪厂和养鸡场成功地分离了30株乳酸菌,获得了6株具有耐酸和耐胆盐的高生存性乳酸菌(菌株分离采用厌氧培养法),并对这6株菌的耐酸以及耐胆盐特性进行了详细的分析。1材料和方法1.1培养基mrs1.1.1样品来源传统乳制品(酸奶和酸驼乳):阿拉善牧区(随机采集,采集后4℃保藏备用)。猪:呼和浩特市赛罕区快活林养猪场(随机抓取猪,然后取其肠内容物分离目的菌株)。鸡:前不塔气村养鸡场(随机抓取鸡,然后取其肠内容物分离目的菌株)。1.1.2培养基MRS液体和固体培养基。1.1.3主要试剂牛胆盐3号(BD),Becton,Dick-insonandCompany;猪胆盐,广东环凯微生物科技有限公司050110。1.2菌株的活化与培养1.2.1菌株的分离纯化将采集到的样品做10×稀释,选取合适的稀释度涂布MRS平板,37℃厌氧培养48h,挑取单个可疑菌落进行涂片、革兰染色、镜检,选择G＋菌且无芽胞的菌株,继续在MRS［６］平板上反复划线纯化,液体培养,将菌液与灭菌甘油按1∶1混合置于-20℃冰箱进行菌种保藏。1.2.2菌株的耐酸性试验1.2.2.1将甘油保护剂中保存的菌株在MRS液体培养基中连续活化3代。1.2.2.2活化好的菌液在4000r/min离心25min,弃去上清液,沉淀菌体用灭菌MRS液体培养基洗涤3次,将菌体重悬于此培养基中并调整菌悬液浓度为3.0×10８cfu/mL。1.2.2.3用浓度为1mol/L的HCl和1mol/L的NaOH将菌液的pH调整为2和3两个试验梯度,放入37℃恒温培养箱中,2h后取出,立即做梯度稀释,选取合适的稀释度吸取1mL稀释液涂布MRS平板,37℃培养48h后计数菌落,记录结果并计算其存活率,做3个平行试验求平均值［７］。同时用放置0h的菌液作为对照。1.2.3菌株的耐胆盐试验取上述1.2.2中制备的菌悬液分组,分别加入1.0、2.0、3.0g/L的猪胆盐和牛胆盐,放入37℃恒温培养箱中3h取出,立即做梯度稀释,选取合适的稀释度吸取1mL稀释液涂布MRS平板,37℃培养48h后菌落计数。存活率计算公式同上。2结果2.1分离菌种比例2.1.1菌株分离鉴定结果试验结果初步表明,分离到的30株均为乳酸菌(表1)。由表1可知,乳杆菌共18株,占所分离菌株的60%;乳球菌共12株,占所分离菌株的40%。2.1.2经过初筛得到的6株乳酸菌分别命名为LS、LZ1、LT、LJ1、LZ2、LJ2,其菌落特征及菌体形态见表2。2.2u3000ls和lj2的存活率经耐酸试验,分离到的6株乳酸菌对pH2.0和pH3.0的不同生长环境表现出不同程度的耐受性。有2株菌在pH2.0环境下存活率高达135%和124%,分别是LS和LJ2,它们在pH3.0条件下也具有较高存活率;LZ1和LT在pH2.0条件下存活率较低,仅为23%和19%,而LZ1在pH3.0时存活率可达137%;其余菌株的存活率从43%~82%不等,结果见表3。2.3菌株的生存率及致病结果2.3.1不同浓度猪胆盐中菌株耐受结果不同浓度猪胆盐中菌株耐受结果如表4。在猪胆盐浓度为1.0g/L时各株菌的生存率变化很大,从最低的49%到最高的132%之间;当胆盐浓度为2.0g/L时,各株菌的生存率较1.0g/L时有所降低,平均为59%;当胆盐浓度达到3.0g/L时,存活率明显降低,平均为45%。其中LJ1在各浓度胆盐中的存活率都达到了60%以上,在3.0g/L时高达69%,最为稳定。2.3.2不同浓度牛胆盐中菌株耐受结果不同浓度牛胆盐中菌株耐受结果见表5。本试验中的6株菌在不同浓度的牛胆盐中也有不同程度的存活率,其中LT菌株在各浓度条件下都表现出较高的存活率,分别为100%、89%、99%,其他各菌株的耐受能力随着胆盐浓度的提高而降低。3菌株在胆盐中的生长特性乳酸菌具有调节肠道菌群、增强机体免疫力等益生作用［８－１０］。而乳酸菌能够充分发挥益生作用的前提是可以大量、有活性地通过家畜胃肠道,家畜胃肠道微生物众多,胃酸、胆汁构成了一道天然屏障,只有那些高活性的乳酸菌能够耐受这样的内环境,所以本实验的主要目的是鉴定分离到的乳酸菌是否具有高的生存性。动物肝脏分泌到十二指肠中的高浓度的胆酸盐具有抗菌活性,它对细胞膜有很强的破坏能力,其疏水作用能使乳酸菌细胞膜膜脂溶解,导致膜蛋白离解和细胞膜破裂。本试验分离株LJ1在猪胆盐中表现较高存活率,高达132%,而在牛胆盐中分离株LT存活率达到100%。由此可以看出,不同菌株在不同的胆盐培养基中的存活率有较大差异。对哺乳仔猪而言,其胆囊内胆汁量很少,在出生后3周内胆汁量增加缓慢［１１］,一般在0.3g/L~3.0g/L范围内波动,本试验所用试验猪均非哺乳仔猪,胆汁生成量充足,可以促进大量乳酸菌细胞膜的破裂,从而表现较高的生存活性,因此对猪胆盐表现出较高的耐受能力。同时,胆盐能在动物小肠形成高渗透压环境,而多数动物肠道胆盐浓度范围为0.3g/L~3.0g/L。［１２］所以本试验选择胆盐浓度范围在1.0g/L~3.0g/L。ChouLS等［１３］研究发现用胆盐选择性驯化乳杆菌的胆盐耐受性是有效的,经过几代胆盐驯化后得到的乳杆菌耐胆盐的能力比亲代乳杆菌强,而本实验结果得到的乳酸菌LJ1和LT未经过不同酸度、不同胆盐浓度的培养基驯化,就有较强的耐酸和胆盐耐受性,这一结果与这些菌株的特殊生存环境有密切关系,即当地酸度比较高的发酵奶,而且此类发酵乳制品的发酵剂也是已发酵的驼奶,他们不做酸驼奶时,低温保存已发酵的酸驼奶,这种制作工艺恰恰给其里面的乳酸菌赐予自然驯化的生存环境,因此这些乳酸菌具有一定的耐受性。这些菌株在进一步确定其它益生能力后