薄皮甜瓜品种的固相微萃取-气相色谱-质谱联用分析

薄皮甜瓜品种的固相微萃取-气相色谱-质谱联用分析

薄皮杏仁是一种生态品种。这种水果又甜又香。因此，也被称为“香茶”。它在中国东北和华北广泛种植。这是夏季的一道美丽风景。通常根据果皮颜色和果肉质地将其分为几大类群:白皮品种群、黄皮品种群、花皮品种群、绿皮品种群和粉质(面瓜)品种群等,不同类群薄皮甜瓜各有其独特的风味。国外对厚皮甜瓜果实的芳香物质成分进行了相关研究,已表明其果实含有大约240种挥发性物质,主要为酯类、醛类、醇类及含硫化合物等,其中约100种物质得到了鉴定。Aubert等利用二氯甲烷直接提取和气相色谱—质谱(GC-MS)、气相色谱(GC-FID)方法分析15个Charentais甜瓜品种时发现,不同成熟期和货架期的品种,其香气种类和含量存在差异。Kourkoutas等分析了Cantaloupe、Galia和HoneyDew甜瓜的芳香组分发现,Cantaloupe甜瓜中含有大量的含硫酯类和直链六碳化合物,而HoneyDew甜瓜以一种九碳直链化合物为主,Galia甜瓜中甲基酯类相对较高。张东晓的研究也表明,不同品种间的日本甜瓜香气有差异,酯类是其香气的主要成分,其中乙酸乙酯占香气总量的50%~60%。唐贵敏等发现山农金黄1号成熟甜瓜果实挥发性物质主要为酯类物质,而SweetDelight成熟果实挥发性物质主要为醛类物质。这也说明甜瓜品种间的香气差异较大,不同品种香气成分不同。薄皮甜瓜与厚皮甜瓜相比,香气更加浓郁,但是,有关不同类群薄皮甜瓜果实香气的主要成分构成尚鲜有报道,目前对其还缺乏系统研究。本研究采用固相微萃取(HS-SPME)-GC-MS,并结合GC-FID,对5个薄皮甜瓜品种类群的典型品种成熟果实中香气成分进行定性和定量分析,旨在明确不同薄皮甜瓜类群果实的香气构成、主要芳香物质含量,为科学评价和鉴定甜瓜的香气品质奠定基础,并为甜瓜风味育种提供借鉴和依据。1材料和方法1.1材料与试材菌株根据薄皮甜瓜果皮颜色的不同,同时兼顾果实质地差别,选择白皮品种玉美人(长春一间堡蜜世界甜瓜研究所)、黄皮品种龙甜3号(黑龙江省农业科学院园艺分院甜瓜育种研究室)、花皮品种高甜黄金道(辽宁省丹东市华天农业有限公司)、绿皮品种日本甜宝(MIKADO国际种子株式会社)和粉质(面瓜)品种香沙蜜(河北保定种苗公司)为试材。试验于2008年2—7月在沈阳农业大学园艺科研基地日光温室内进行。2月20日播种,采用50孔穴盘,基质育苗,基质组成为草炭∶蛭石=2∶1。当薄皮甜瓜苗生长到3~4片真叶时(3月21日)定植于日光温室内。采用随机区组排列,每3畦为1个小区,3次重复。高畦栽培,畦宽80cm,每畦定植双行,行距60cm,株距45cm。黑色地膜覆盖,滴灌浇水。栽培过程中采用单蔓整枝,在主蔓10节以上连续留瓜,单株留瓜4个。对当日盛开的雌花进行挂牌标识。采收时选择无病虫害、无机械损伤且已具有成熟特征的果实。玉美人、龙甜3号、高甜黄金道、日本甜宝、香沙蜜中心可溶性固形物含量(手持折光仪测定)分别为11.6%、11.5%、12.8%、11.8%、10.4%,均达到了生理成熟,采后可立即进行芳香物质的测定。1.2仪器、试药和仪器仪器采用Aglient6890/5973NGC-MS联用仪,由美国Aglient公司生产;CP-3800气相色谱仪,由美国Varian公司生产;手动SPME进样器,100μm聚二甲基硅氧烷(PDMS)萃取头,由美国Supelco公司生产。标准样品:乙酸乙酯、乙酸-2-甲基-1-丁酯、乙酸己酯、乙酸苯甲酯,购自Sigma公司和Dikma公司;内标1-辛醇,为色谱纯。1.3gc-ms分析条件取样及前处理:每个品种的果实每小区取3个,共9个。清水和去离子水冲洗干净后,用四分法切取1/4果实,去除瓜瓤,取果肉质量约200g,切成2~3cm小块,用榨汁机打成匀浆,用4层纱布过滤去除泡沫,取0.5mL瓜汁加入到2mL顶空瓶中,添加0.2g分析纯NaCl,加盖,振荡使其溶解。将老化2h的固相微萃取头插入样品瓶的顶空部分,推出纤维头,与瓜汁液面保持0.5cm距离,40℃萃取30min。GC-MS参数条件及分析条件:参考马永昆等、阎振立等方法,使用Aglient6890/5973NGC-MS联用仪,HP-5MS极性色谱柱,进样口温度250℃,解吸3min,不分流进样,程序升温,柱温40℃保持2min,10℃·min-1升到100℃,8℃·min-1升到250℃,保持10min。载气为He气,柱流量1mL·min-1。质谱条件:电离方式EI,电子能量70eV,全扫描方式,扫描范围:30~500m·z-1,四极杆温度150℃,离子源温度230℃。各组分经过NIST/WILEY普库检索及资料分析,各组分相对含量通过面积归一化法计算。气相色谱条件:采用CPsil8CB的柱子,分流比为10∶1,36℃保持2min;12℃·min-1升到60℃,然后以6℃·min-1到140℃,再以10℃·min-1的速度到240℃,保持8min;进样口250℃,检测器300℃,柱流速2mL·min-1。1.4甜瓜汁的制备为了比较真实地接近甜瓜汁,并最大程度地模拟果汁体系,消除由SPME和其他体系带来的系统误差,试验以脱香果汁为基体加入混合标样,果汁脱香方法参照陈计峦等的方法,并略有改动。主要方法如下:用四分法取约1kg甜瓜,清洗后进行切分、去瓤、榨汁和过滤。取300mL甜瓜汁在70℃下用旋转蒸发仪进行浓缩,去除其中大部分芳香成分。当果汁浓缩至70Brix(白利糖度)后,将果汁冷却,放入分液漏斗中用正己烷(1∶1,v/v)萃取2~3次,除去剩余芳香成分,最后将果汁还原至浓缩前的糖度。取0.5mL脱香果汁,固相微萃取后用气相色谱检查果汁中的香气是否脱除干净。1.5内标和外标的制备根据定性分析结果,5大薄皮甜瓜类群的代表品种均含有乙酸乙酯、乙酸-2-甲基-1-丁酯、乙酸己酯和乙酸苯甲酯,并且含量较高,因此,确定这4种酯类为薄皮甜瓜果实中的主要香气物质。用色谱纯甲醇配制这4种酯类标样的混合液,同时,向混合液中加入内标1-辛醇。外标浓度根据样品含量多少而定,分别稀释至1、2、4、8、16和32倍,分别加入到0.5mL脱香果汁中,内标质量浓度始终为59.5mg·L-1,在相同的SPME和色谱条件下进行萃取分析。由此方法得到4条标准曲线,根据标准曲线进行主要芳香物质的定量。2结果与分析2.1不同品种果实酯类组分含量的对比玉美人、龙甜3号、高甜黄金道、日本甜宝、香沙蜜等果实香气成分的GC-MS总离子图见图1。共检测出37种挥发性成分(表1),主要包括酯类、醛类、醇类、酮类、羧酸类、烃类等物质,其中酯类19种、醛类2种、酮类7种、羧酸类4种、醇类2种、烃类2种及其他类1种。通过对各成分离子面积和总离子面积归一化求得各成分的相对百分含量。玉美人、龙甜3号、高甜黄金道、日本甜宝和香沙蜜分别检测出15、13、15、14和18种香气成分,分别占总峰面积的90.05%、88.96%、90.82%、93.55%和84.49%。各个甜瓜品种果实中酯类均为主要香气成分。玉美人果实中主要酯类成分含量由高到低依次为乙酸乙酯、乙酸-2-甲基-1-丁酯、乙酸苯甲酯、2,3-丁二醇二乙酯和乙酸己酯。龙甜3号果实中酯类成分含量由高到低依次为乙酸乙酯、乙酸-2-甲基-1-丁酯、2,3-丁二醇二乙酯、乙酸烯丙酯和乙酸苯甲酯。高甜黄金道果实中酯类成分含量由高到低依次为乙酸乙酯、乙酸-2-甲基-1-丁酯、乙酸苯甲酯、乙酸异丁酯、乙酸仲戊酯和乙酸己酯。日本甜宝果实中酯类成分含量由高到低依次为乙酸乙酯、2,3-丁二醇二乙酯、乙酸苯甲酯、乙酸-2-甲基-1-丁酯和乙酸己酯。香沙蜜果实中酯类成分含量由高到低依次为乙酸乙酯、乙酸苯甲酯、乙酸-2-甲基-1-丁酯、乙酸异丁酯、2,3-丁二醇二乙酯、乙酸己酯和邻苯二酸二辛酯(表1)。5个品种中共有的芳香物质有4种,分别是乙酸乙酯、乙酸-2-甲基-1-丁酯、乙酸己酯和乙酸苯甲酯。分别占各甜瓜品种果实挥发性物质总量的81.67%、82.76%、81.07%、84.95%和49.71%,对薄皮甜瓜果实风味起决定性作用。因此,这4种成分含量的高低直接影响甜瓜果实风味的好坏。同时,在5个薄皮甜瓜品种的成熟果实中,均存在一些特有的酯类物质:即在其他品种成熟甜瓜中没有检测到的物质。玉美人为乙酸香草酯(相对含量仅有0.11%),对该品种甜瓜香气贡献较小或可忽略。龙甜3号特有酯类为乙酸烯丙酯(相对含量达1.18%)。高甜黄金道特有酯类是乙酸仲戊酯、异戊酸甲硫酯和1,2-乙二醇单乙酸酯,其中,乙酸仲戊酯相对含量达2.7%,其他2种相对含量均很低。日本甜宝特有酯类是1,2-丙二醇二乙酸酯(相对含量0.08%)。香沙蜜特有酯类为乙酸辛酯(相对含量0.84%)、乙酸-2,6-二甲基-3-辛醇酯和乙酸-6-十二醇酯,后两者相对含量均很低(表1)。试验结果表明,共有芳香成分含量的差异及特有芳香成分的存在是造成不同品种甜瓜果实风味不同的原因。2.2几种主要甜宝果实主要成分含量乙酸乙酯在5个品种中含量均为最高,含量由高到低分别是玉美人(898.21mg·kg-1)>日本甜宝(883.01mg·kg-1)>高甜黄金道(729.58mg·kg-1)>香沙蜜(255.00mg·kg-1)>龙甜3号(113.96mg·kg-1)。日本甜宝果实中乙酸乙酯含量仅次于玉美人,其他几种成分含量居中。乙酸-2-甲基-1-丁酯在玉美人和高甜黄金道甜瓜中含量相当,均高于其他3个品种。高甜黄金道中乙酸苯甲酯和乙酸己酯含量最高,龙甜3号乙酸苯甲酯最低。而面瓜的代表品种香沙蜜,除了乙酸乙酯和乙酸苯甲酯含量略高于龙甜3号外,其他成分含量均为最低。乙酸己酯在各品种中含量最低(图2、表2)。由此可以看出,不同薄皮甜瓜品种主要酯类含量及组成比例不同,因此,决定着不同品种的特征风味。3酯类物质的组成薄皮甜瓜以其香味浓郁而受到消费者的欢迎。本研究采用顶空固相微萃取—气质联用仪,并结合气相色谱仪系统分析比较了东北地区广泛栽培的5大类群薄皮甜瓜代表品种玉美人、龙甜3号、高甜黄金道、日本甜宝和香沙蜜果实挥发性香气成分,分别检测出15、13、15、14和18种香气成分,并得出酯类是成熟薄皮甜瓜果实中的主要芳香成分,而且乙酸酯类在试验甜瓜中所占比例为58.02%~84.95%。这与前人在厚皮甜瓜上的研究结果相似。但是,试验所选薄皮甜瓜成熟果实中,只在高甜黄金道中检测出1种异戊酸甲硫酯(相对含量0.38%),香沙蜜果实中检测到1种硫醚。其他3个品种中均没有检测到含硫酯类或其他含硫芳香成分,而硫酯被认为是厚皮甜瓜中的重要香气成分。这可能是不同生态类型甜瓜果实香气差异的主要方面。不同的香气化合物由于阈值及在样品基质中浓度的不同,对果实香气的贡献会不同,仅凭某种香气成分含量的高低不能准确判断其对样品整体香气贡献的大小,只有具有较高香气值(aromavalue=浓度香气阈值)的成分才是果实的特征香气。试验所选5个薄皮甜瓜品种成熟果实中共有的酯类物质是:乙酸乙酯、乙酸-2-甲基-1-丁酯、乙酸苯甲酯和乙酸己酯。这4种酯类物质阈值较低,因而它们具有较高的香气值,是5个薄皮甜瓜品种果实中主要的特征香气成分。不同的酯类具有不同的风味,乙酸乙酯具有甜水果香气,乙酸-2-甲基-1-丁酯是苹果中的典型香气,乙酸己酯是具有清新感的草原香气类,而乙酸苯甲酯是瓜类生臭气味的主要成分。因此,这4种酯类物质含量多少及组成比例是影响薄皮甜瓜果实风味优劣的重要指标。各香气成分在种类、含量和相互之间构成比例的差异是导致薄皮甜瓜果实整体香气不同的原因。当然,5个供试品种中,还含有其他酯类成分,如2,3-丁二醇二乙酯(高甜黄金道中未检测到)和乙酸异丁酯(龙甜3号中未检测到),在其他几个品种中含量相对较高,这2