濒危野生植物及其制品物种鉴定规范     

濒危野生植物及其制品物种鉴定规范     1范围本标准规定了定濒危野生植物及其制品物种鉴定时物种鉴定的一般原则、物种鉴定指标、实验室区域设置、岗位设置、人员资质要求与管理、检验鉴定程序、检验方法的认可、污染预防与处理、安全防护、际国内合作与援助、持续能力提升等主要技术内容。本标准适用于濒危野生植物及其制品物种的鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB15569农业植物调运检疫规程GB/T27025检测和校准实验室能力的通用要求SN/T1193基因检验实验室技术要求GB19489实验室生物安全通用要求GA/T382法庭科学DNA实验室规范GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测SN/T3500进出口食品安全生物学检测抽样规范SN/T4626DNA条形码物种鉴定操作规程LY/T2501野生动物及其产品的物种鉴定规范3术语及定义3.1濒危野生植物endangeredwildplant本标准特指cites目录及国家保护植物目录里的植物。3.2濒危野生植物产品endangeredwildplantproducts前款所指濒危野生植物的任何部分及其衍生物。3.3物种鉴定speciesIdentification采用形态学、生物化学、分子生物学等检验技术，对濒危野生植物及其产品进行分类地位（科、属、种）的认定。3.4检材checkmaterials&checksamples委托单位（人）提供的、用作物种鉴定的濒危野生植物及其产品。3.5宏观形态学macromorphology通过濒危野生植物植株形态特征进行鉴定的科学方法。3．6微观形态学micromorphology通过濒危野生植物部分结构特征进行鉴定的科学方法，一般需借助放大设备。3.7基因条码技术DNAbarcoding采用基因测序技术对物种的基因条码进行识别，利用其种内特异性和种间多样性实现对物种的快速鉴定的技术。3.8Sanger测序法Sangersequencing以单链或双链DNA为模板，在DNA聚合酶的催化下延伸结合在模板上的引物，直到掺入一种链终止核苷酸为止。每个反应含有四种dNTP，并混入用同位素或荧光标记的ddNTP，使XX的寡聚核苷酸选择性终止，通过髙分辨率变性毛细管电泳分离片段获得碱基顺序的方法。ITSITS是内源转录间隔区（

Internally

Transcribed

Spacer）的英文缩写，

位于rRNA

编码基因18S，5.

8S和28S之间的小基因片段。PCRpolymerasechainreaction聚合酶链式反应又称体外DNA扩增技术是利用DNA在体外高温时变性会变成单链，低温时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至PCRpolymerasechainreaction聚合酶链式反应又称体外DNA扩增技术是利用DNA在体外高温时变性会变成单链，低温时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5'-3'）的方向合成互补链。缩略语BOLD：生命条形码数据系统（TheBarcodeofLifeDataSystembptbp：碱基对（Basepair.）CTAB:十六烷基三甲基溴化铵（CetyltrithylammoniumBromide）DNA:脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）dNTP:脱氧核糖核苷三磷酸（DeoxyribonucleosideTriphosphate）ddntp:TaqDNA聚合酶:耐热DNA聚合酶（TaqDNAPolymerase）Tris:三（羟甲基）氨基甲烷[Tris（hydroxymethyl）Aminomethane]物种鉴定原则5.1根据具体案（事）件缩小目标物种的范围、确定适用的检验鉴定方法。5.2形态特征完整、物种特征鲜明的检材，采用宏观形态学方法进行检验鉴定。5.3具有物种特异性的微观结构特征的检材，采用微观形态学方法进行检验。5.4具有物种特异性生化成分的检材，可采用生物化学方法进行检验鉴定。5.5采用宏观形态学方法无法进行物种鉴定（但能够提取DNA的检材）可采用生化和分子生物学方法进行检验鉴定。5.6宏观形态学方法中具有物种唯一性的特征指标可以单独使用，如指标特征不具有物种唯一性，则应联合使用2个以上指标做出鉴XX论。5.7如果单独使用一种分子生物学方法不能可靠地确认来源物种，则应使用两种以上方法进行联合印证。物种鉴定指标宏观形态学指标以物种典型或特异的形态特征作为鉴定指标（参见中国植物志）。微观形态学指标根据种子、花、等组织的典型或特异性的微观形态学指标。生物化学指标以物种典型或特异的生化特征、在阴性和阳性严格对照下作为鉴定指标。分子生物学指标以物种DNA长度多态性和序列多态性作为分子生物学指标。应经过有效性验证。仪器和试剂要求7.1仪器7.1.1实验室应配置与其所应用的检验方法所必需的仪器设备，且应是具有资质的实验仪器设备厂家生产的合格产品。7.1.2检验方法所必需的关键（核心）设备所产生的数据或结果应能够被同行认可。7.1.3仪器设备应定期进行检查、保养和校正。7.1.4新购置的仪器设备、或原有仪器设备维修保养后，在使用前应当校准或测试。实验耗材和试剂7.2.1实验室应配置与其所应用的检验方法所必需的实验耗材和试剂，且应是具有资质的厂家生产的合格产品。7.2.2所有实验耗材和试剂应处于保质期或有效期内。7 .2.3商品试剂盒应标明到货日期和有效期。实验室自行配制的试剂应在容器上标明名称、浓度、配制时间、配制人、保存条件、失效日期等相关内容。7.2.4每一批次购进的耗材和试剂应进行符合性验证等质控检验。实验室区域设置8.1实验室基本要求8.1.1实验室应设立完善的组织机构、质量保障和管理体系。8.1.2实验室的各功能分区应布局合理，通风良好、光线适度、设备完善，达到检验鉴定的要求。8.1.3配备生物安全设施，确保环境不受濒危野生植物携带病原的污染。8.2实验室区域设置原则8.2.1实验室区域设置的一般原则区域设置应符合实验流程，避免实验过程中检材和试剂受到污染，保障结果的可靠性。8.2.2基本区域设置8.2.2.1宏观形态学检验、微观形态学检验、生物化学检验和分子生物学检验应分别设置检验区域。8.2.2.2微观形态学检验室和生物化学检验室应分别设置样品制备和检验两个基本区域。8.2.2.3分子生物学的DNA检验室应设置样品前处理、核酸提取、试剂配置、PCR扩增加样、PCR扩增、产物分析七个基本区域。8.2.3其他区域设置8.2.3.1检材贮存室：主要用于送检材料的妥善保管和贮存。8.2.3.2初检室：主要用于案件的登记、检材的初检和照相、录相、固定等。8.2.3.3试剂贮存和配制室：主要用于试剂的贮存、配制、消耗品的消毒等。8.2.3.4数据分析室：主要用于检验结果的分析、比对、鉴定报告的形成等。8.2.3.5档案室：主要用于案件资料、实验操作相关资料的存档保存等。岗位设置、人员资质要求及管理9.1工作人员包括鉴定人和鉴定助理等应遵守国家有关法律法规，诚实守信，有良好的职业道德操守，严格遵守海关相关规定和要求，严格保守秘密。9.2技术负责人应具备博士学位或具有副高级以上专业技术职称，相关专业，五年以上相关工作经验，具备形态学和分子生物学相关专业背景和熟练操作技能，了解濒危动物物证鉴定领域的前沿技术。9.3鉴定人应具备中级以上专业技术职称，相关专业，在相关实验室工作一年以上，并通过能力验证或实验室间比对等测试。9.4鉴定助理应具备本科以上学历，相关专业，具有6个月以上相关技术培训的经历。9.5必要时，技术负责人和鉴定人按照有关要求有配合相关部门履行结果解释和出庭义务。样品鉴定10.1样品受理10.1.1鉴定受理应由专门人员负责，受理人应验明委托单位的有效证明材料。10.1.2送检人应填写送检登记表，详细填写送检单位、送检人姓名、送检日期、检材类型、数量及特征、鉴定要求等基本情况，并进行检材的交接、拍照或录像存档。10.1.3检材应提取实物样品以备复核检验，并告知。10.1.4检验鉴定如需对检材进行破坏性取样而严重改变其原有价值的，应征得委托单位同意。10.1.5无法鉴定的，经技术主管同意后方可退回委托单位。10.1.6检材进人实验室后应贴上标签并填写检材处理表，由专人管理；待检、在检和巳检的检材应分别存放；转移检材或使用时经手人应签名。10.2检验鉴定原则本着由简单到复杂、由无损到有损的原则，确定检验鉴定方法。10.3检验鉴定10.3.1宏观形态学方法根据检材的形态特征，进行判别。10.3.2微观形态学方法根据检材类别，选择适当的检验方法，并确定样品制备方法。显微图片应标注放大倍数。10.3.3生物化学方法根据检材类别，选择适当的检验方法，确定样品制备方法，检验时应设置标准样品对照。实验应重复1次以上。10.3.4分子生物学方法（见附录A）DNA提取根据鉴定目标选择的检验方案确定DNA提取的方法，应设置空白对照并严格防止样品相互污染。需要纯化的DNA，可选择高质量纯化试剂盒或其他纯化方法。PCR扩增严格设置阳性（巳知的DNA样品）和阴性（不加DNA的空白）对照。检验时样本要在分子量标准之间的泳道上电泳。应重复1次以上。扩增产物的纯化采用纯化试剂盒或其他同行公认的纯化方法。10.3.4.5测序产物应双向测序。采用克隆测序时每个PCR产物应测定5个以上。10.3.5检材的后处理10.3.5.1检验鉴XX束后，除留存备份样品以外，剩余的检材返还委托单位。10.3.5.2变质和超过保留时限的检材，及携带疫病的检材应进行无害化处理。10.4结果分析检验后，对检验结果进行分析，能够明确给出认定或否XX论的，形成鉴定意见。10.5复检检验应保证两次重复检验。10.6鉴定的复核对鉴XX果不明确或其他特殊需要，按有关程序经同意可送相关权威机构进行复核鉴定。10.7鉴定质量控制（1）对鉴定过程中出现结果明显偏离和错误，鉴定人应立即报告技术负责人，并停止鉴定工作。技术负责人应与鉴定人一起对影响鉴定的各个环节（包括样品、仪器、试剂、分析方法、实验环境和污染等）逐一排查，确定问题来源，并整改。整改应有记录，并存档。（2）对影响鉴XX果的关键设备和试剂，实验室除定期进行校准、验证和维护外，还应进行期间核查。期间核查应有计划，并记录存档。（3）实验室应制定计划组织内部评审、质量评审、管理评审、参加能力验证和实验室间比对等，以确保对鉴定质量的有效控制。评审过程和评审发现的问题应形成评审报告，并存档。10.8鉴定报告起草形成明确鉴XX论的，起草鉴定报告。报告应有一定的格式（可参照有关标准）。鉴定人对鉴XX果负责，须在鉴定报告书上签名。10.9鉴定报告的审核、签发技术负责人负责鉴定报告内容的审核，实验室负责人负责鉴定报告的签发。最后，鉴定报告加盖公章后生效。检验方法的认可11.1认可的或有效验证的标准11.1.1有选定的标准样品。11.1.2灵敏度检验：确定能可靠鉴定所需的最小样本量。11.1.3物种群体遗传学调查适用性。11.1.4具有特异性、适用性、稳定性或通用性。PCR及相关检验方法的认可见GA/T382—20027.4。11.2新方法的使用在现有方法无法解决的情况下，需采用新方法进行检验鉴定时，应由同行专家组成的专家组认可。11.2标准方法确认（1）根据检材的需要和实验室的实际情况优先选择使用标准方法。（2）实验室在采用标准方法之前，应对实验室能否正确执行该标准方法进行确认。具体确认要求按GB/T27025《检测和校准实验室能力的通用要求》执行。（3）如实验室采用的标准方法发生了改变，实验室应重新进行确认。11.3非标方法确认非标方法包括海关总署下发的技术文件、其他实验室采用、权威刊物发表和实验室自行研制的尚未形成标准的鉴定方法。非标方法应符合GB/T27401《实验室质量控制规范动物检疫》要求。实验室在没有标准方法或现有标准方法无法完成鉴定的情况下可考虑采用非标方法，但必须经过如下验证确认。（1）其他实验室采用、权威刊物发表非标方法须经至少6家实验室联合验证确认。（2）实验室自行研制的鉴定方法须经同行专家组成的专家组审核，并经至少6家实验室联合验证确认。档案资料12.1检验档案12.1.1登记资料：包括受理记录、送检单位的委托证明材料、检材照片、检材保管或返回记录、检验中交接记录、鉴定文书的发放记录等。12.1.2检验记录资料：根据不同检验方法所需要的不同资料，如形态学的各种量度、检验记录，生化检验的实验记录，分子生物学的DNA提取记录、PCR反应记录、电泳检验记录、测序结果、数据处理等。12.1.3图谱图片：包括扫描电镜照片、光镜照片、仪器分析图表、照片、自显影图、干燥胶等。12.1.4鉴定文件：包括鉴定意见书或检验报告、检验结果图谱等。12.2操作手册12.2.1实验方法类：植物及其器官的制备方法及程序；扫描电镜样品的制备方法及程序；特殊成分的生化检验方法；各种DNA提取方法、DNA定量方法、检验方法和各种物种鉴定方法及程序等。12.2.2仪器操作类：各种仪器的操作使用方法、维护方法。12.2.3试剂配制类：各种试剂的配制方法、贮存方法。12.3说明书类重要仪器设备说明书、特殊试剂盒操作说明书、特殊试剂说明书等应留档备查。12.4方法认可记录检验方法等的认可程序、专家会议纪要、认可过程记录等。12.5管理档案实验室质量控制守则、实验室管理规则、安全操作守则、人员培训记录、实验室核查记录、资格测试记录、实验室运行记录（包括主要仪器设备的使用记录、保修和维修记录、突发事件处理记录等）等。12.6其他资料物种检验鉴定工作流程图、仪器设备清单、储存试剂的清单等。12.7电子化管理对检验鉴定文书、备份样品名录等建立数据库，进行电子化管理。12.8保密凡检验鉴定文书应在指定地点由专人负责保管，未经主管领导书面同意不能复制、外借，更不可遗失。主管领导签发的复制和外借凭证应与检验鉴定文书一起存档保存。生物安全预防与处理13.1检材样品13.1.1取样时，根据样品特点，应取深层组织、或清洗掉外层附着物，减少外源性污染。13.1.2各样品应标记清楚，防止各样品间的混淆、以及与巳知样品的污染。13.2检验人员13.2.1检验人员应严格按检验规程操作。13.2.2进人实验室应穿实验室工作服和工作鞋。13.2.3检验操作中应戴一次性手套，一旦手套被污染应马上更换。13.2.4根据检验的需要应戴实验室专用帽子、口罩和防护眼镜。13.3检验区域13.3.1检验开始前应用75%乙醇将工作台擦洗干净，检验结束后用10%次氯酸钠再擦洗所有的工作台面。13.3.2检验室应定期清洁并进行紫外灯照射消毒。PCR区域应使用专用清洁工具。13.4检验器材13.4.1各区域应配置专用的移液器、试剂架等，不应拿到其他区域使用。13.4.2试管使用前应高压灭菌。13.4.3可高压灭菌的移液器等在使用前应高压灭菌；无法高压灭菌的应定期用75%乙醇和纯水清洗，使用前再用紫外灯照射。13.5检验过程13.5.1开启试管前应瞬时离心。13.5.2应使用一次性移液吸头。13.5.3蛋白质类生化试剂应分装成小包装。13.5.4分子生物学检验应设置阳性和阴性对照。安全防护14.1急救装置在实验室的固定位置应设急救箱和紧急喷淋装置，并有明确标识，所有人员应掌握使用方法。14.2化学药品14.2.1化学药品应标记清楚，应有专门存放程序和记录。14.2.2化学药品的弃置应按专门程序进行，并备详细记录。14.2.3特殊药品使用前应有专门培训。14.3仪器操作14.3.1仪器操作说明中应注明该仪器操作中发生事故或故障的可能性及原因，并注明预防和处理的方法。14.3.2应按规定对仪器定期进行检查、保养。14.4检验人员14.4.1检验人员必须认真学习检验规程和有关的安全技术规程。14.4.2在使用前应了解化学药品的毒性，并清楚急救方法。14.4.3在使用前应了解设备性能及操作中可能发生事故的原因，掌握预防和处理事故的方法。14.4.4检验室内禁止吸烟、进食，严禁用试验器皿处理食物。14.4.5离开检验室前用清洁用品洗手。14.5植物疫病处理来自野生濒危植物检材时，应考虑到检材可能携带病原体，并注意防范疫病的传染、传播。取样可按照SN/T1809-2006相关规定操作执行。14.6废弃物处置、电气设备、放火、紫外光源和激光光源按照GB19489的相关规定执行。国际国内合作与援助15.1建立国内外濒危植物鉴定实验室间合作机制。15.2经主管部门同意，允许在国内和国际合作伙伴间共享数据，以便在必要时进行解释分析，协助国际调查。15.3收集用于鉴定分析象牙等濒危动物的技术文献资料。15.5与技术先进的研究机构和犯罪调查专家合作开展能力建设和培训。持续能力提升16.1对参与鉴定过程的鉴定工作人员进行培训，以不断提高鉴定人员的技术能力。16.2实验室每年至少一次参加由权威机构组织的能力验证。16.3实验室制定计划开展实验室间比对。16.4跟踪国际最新科技发展前沿，开展科学研究和标准制修订工作，并把成果应用于日常鉴定工作。附录A

（资料性附录）

PCR基本资料对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术，是传统形态鉴别方法的有效补充。由于不同物种的DNA序列是由腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）四种碱基以不同顺序排列组成，因此对某一特定DNA片段序列进行分析即能够区分不同物种。DNA条形码分子鉴定通常是选用ITS2/ITS为主体序列，以叶绿体为辅助序列。一、仪器的一般要求。所用仪器有电子天平、离心机、聚合链式反应（polymerasechainreaction，PCR）仪、电泳仪和测序仪DNA序列测定用测序仪，是一台具有自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段中碱基顺序或大小，以及定量用精密仪器，测序方法主要采用双脱氧链终止法，又称Sanger法。4种双脱氧核酸（ddNTP）的碱基分别用不同的荧光进行标记，在通过毛细管时，不同长度的DNA片段上的4种荧光基团被激光激发，发出不同颜色的荧光，被电荷耦合元件图像传感器
（charge-coupleddevice，CCD）检测系统识别，并直接翻译成
DNA序列，获得供试品的峰图文件和序列文件。二、测定步骤本法主要包括供试品处理、DNA提取、DNA条形码序列PCR扩增、电泳检测和序列测定、序列拼接及结果判定，主要步骤如下。1.检材处理为防止外源微生物污染，检材使75%乙醇擦拭表面后晾干，或采取其他有效去除微生物污染的方法。