小青龙汤对copd大鼠核因子b和-gcs的影响

小青龙汤对copd大鼠核因子b和-gcs的影响

小青龙汤是张仲景的《伤寒论》。它与麻黄、芍药、细辛、干姜、甘草、桂枝、半夏、五味子一起配合。它可以解寒，水中饮用，肺气恢复，自由释放。临床多用于治疗慢性支气管炎、过敏性鼻炎、支气管哮喘、慢性阻塞性肺气肿、肺心病以及慢性支气管炎急性发作等呼吸系统疾病。本研究通过观察小青龙汤对慢性阻塞性肺疾病(COPD)寒痰蕴肺型大鼠核因子κB(NF-κB)和γ-谷氨酰半胱氨酸合酶(γ-GCS)水平的干预作用,探讨其治疗COPD的机理。1材料和方法1.1龙汤大气制剂动物:健康雄性Wistar大鼠72只,体重200±20g,购于山东大学实验动物中心,SPF级,随机分为3组,即空白对照组24只、寒痰蕴肺造模组24只、寒痰蕴肺治疗组24只。药物与试剂:小青龙汤煎剂,药物组成:麻黄9g,桂枝6g,白芍9g,干姜3g,五味子3g,半夏9g,甘草6g,细辛3g,水煎浓缩为浓度0.6g/ml的浓缩液,饮片由山东中医药大学附属医院中药房提供。通过流通蒸汽灭菌,4℃冰箱保存;指定品牌香烟;脂多糖(lipopolysaccharicle,LPS),产于美国Sigma公司O55:B5;戊巴比妥钠,进口分装,中国医药集团上海化学试剂公司,批号:F20020915;NF-κB一抗、γ-GCS一抗,购于武汉博士德生物工程有限公司。主要仪器:AE200电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)、ImageProPlu4.5图像分析系统。1.2方法1.2.1大鼠的被动吸烟染毒采用宋一平的方法并加以改良建立大鼠COPD模型。1.2.1.1在室温环境中,第1、14天大鼠麻醉后气管内滴脂多糖:将大鼠逐一称重,按50mg/kg体重腹腔注射浓度为0.4%戊巴比妥钠溶液,待大鼠麻醉后,将其固定于解剖台上,头低位暴露声门,将16号静脉套管针沿气管走行快速插入气管,拔出针芯,接1ml注射器,1秒钟内注入溶于注射用生理盐水的浓度为1mg/ml的脂多糖0.2ml(200μg),将大鼠直立,左右旋转,使脂多糖在肺内均匀分布。1.2.1.2第2~28天给予大鼠每天2次香烟烟熏,每次点燃烟丝的重量为9.03g(每支烟烟丝重量为0.645g),持续时间大约1h,间隔4h(滴脂多糖当天不烟熏)。被动吸烟方法:将大鼠放入自制的有机玻璃染毒箱(100㎝×80㎝×50㎝)内,香烟点燃后,用60ml注射器吸满烟雾,然后通过三通管将香烟烟雾快速注入染毒箱内(此操作频率为20次/分),进行大鼠被动吸烟染毒。为减少香烟燃烧所产的水蒸气对大鼠的影响,在箱底放置适量硅胶干燥剂。1.2.1.3二次造模:第22天起大鼠放入-20℃冰箱里冷冻5min/d,连续8d。1.2.2灌胃治疗组第30天起治疗组大鼠每天给与2ml小青龙汤煎剂(相当于成人剂量的7.5倍)灌胃治疗,连续治疗14d。造模组大鼠每天给与2ml生理盐水灌胃。空白对照组不做任何干预,相同室内环境下自由饮食饮水。1.2.3nf-b抗体的未血清学检测石蜡切片经常规脱蜡水化。将切片放入0.01mol/LPBS中5~10min。取出,滴加3ml/L甲醇双氧水孵育30min,封闭内源性过氧化酶。以PBS缓冲液震洗10min×3次后,入3ml/LTween20PBS孵育30min,同上洗涤。微波抗原修复。1∶100兔抗鼠NF-κB抗体(γ-GCS抗体为1∶150)(武汉博士德生物有限工程公司)于4℃过夜,30℃复温1h,1∶500生物素化的羊抗兔IgG孵育2h,PBS震洗后,ABC复合物同上孵育,最后滴加DAB硫酸镍铵加强显色10~15min,PBS终止反应。酒精梯度脱水、透明及中性树胶封片后观察。(实验中用正常兔血清和PBS缓冲液分别代替一抗作为阴性对照和空白对照。)胞核中表现为棕黄色为阳性。每张切片选择内径100~200μm的细支气管、肺泡和小动脉区,数码相机摄取图像,输入计算机,同样条件下摄入物镜标准测微尺,应用ImageProPlu4.5图像分析系统采集和分析图像并计算平均光密度值(即OD值平均光密度值与抗原含量呈正比关系,即光密度值越高,抗原含量越多,阳性表达越强)。统计方法:使用SPSS11.5统计分析软件,运用方差分析进行统计处理,各组数据用x¯±sx¯±s表示,结果显示P<0.05、P<0.01为有统计学意义。2-gcs表达情况实验过程中,有大鼠陆续死亡,解剖尸体发现有1只为肺部生长了巨大的脓肿日久导致呼吸衰竭所致,有3只为气管滴注脂多糖时麻醉过量致死,1只为不明原因死亡。各组大鼠数量如下:空白对照组:24只;寒痰蕴肺造模组:20只;寒痰蕴肺治疗组:23只。结果显示:空白对照组支气管和肺泡上皮细胞和小动脉内皮细胞胞核中弱表达或不表达,造模组γ-GCS在支气管和肺泡上皮细胞、平滑肌细胞以及炎性细胞中都为高表达(P<0.01),经过治疗后,γ-GCS的阳性表达率有明显降低,其差异具显著性(P<0.05)。γ-GCS光密度值测量(见表1)。与空白对照比较,▲P<0.01;与造模组比较,★P<0.05空白对照组支气管和肺泡上皮细胞和小动脉内皮细胞胞核中弱表达或不表达,造模组NF-κB广泛强表达于支气管、肺泡上皮细胞和小动脉内皮细胞胞核中,尤其支气管上皮细胞核中表达最高,而治疗组则表达明显减弱,其差异具显著性(P<0.05),见表2。与空白对照比较,▲P<0.01;与造模组比较,★P<0.053氧化应激与gsh合成相关机理研究COPD是一组以持久性气道阻塞性或气流限制性或通气障碍性为特征的慢性呼吸系统疾病的统称。其发病机制尚未完全明了,目前普遍认为COPD是以气道、肺实质和肺血管的慢性炎症为特征,在肺的不同部位有肺泡巨噬细胞、T淋巴细胞和中性粒细胞增加。激活的炎症细胞释放多种介质,破坏肺的结构和(或)促进中性粒细胞炎症反应。临床上,寒痰蕴肺型COPD症状表现为咳嗽气喘,咳痰色白而清稀,遇冷则甚,胸膈满闷,面色晦滞,畏寒肢冷,舌苔白滑,脉沉迟等。其治法为温肺散寒,化痰利窍,故多以小青龙汤为主方治疗。氧化、抗氧化失衡是导致COPD持续性慢性炎症的重要因素。吸烟引起的氧化应激,及继之发生肺中炎症细胞(中性粒细胞、巨噬细胞等)汇聚,产生外源性和内源性ROS增多,是氧化应激物质的主要来源,导致抗氧化物质GSH减少,上皮细胞屏障功能丧失,渗漏性增加,气道及肺泡损伤。提高细胞内抗氧化剂含量最简便的方法是直接补充抗氧化剂,如:维生素E、GSH及半胱氨酸等,但临床报道指出疗效多不理想。γ-GCS作为GSH的限速酶,有望通过对其信号传导通路的了解进而施加调控,增强γ-GCS活性,从而增加肺中GSH合成,为COPD的治疗指出新的方向。核因子κB是一种重要的转录因子,不仅可以调控免疫细胞的激活、T、B淋巴细胞的发育,还广泛参与机体的应激反应、炎症反应。在COPD中,NF-κB可以通过诱导炎症细胞、免疫细胞、肺气道上皮细胞中许多重要的炎性介质基因的表达,而参与肺部的炎症、免疫反应。且国内外研究表明,氧化应激与NF-κB等调控抗氧化因子的表达关系密切。其机制可能是,细胞在氧化应激下,NF-κB等激活并核转位,与γ-GCS基因启动子相应位点结合,启动mRNA转录,随后γ-GCSmRNA进入胞浆翻译合成γ-GCS,催化GSH合成增加,参与抗氧化作用。本研究中,造模组免疫组化显示γ-GCS和NF-κB