酱油中氯丙醇的产生、毒性及检测技术

酱油中氯丙醇的产生、毒性及检测技术

发酵饮料是人们日常生活中不可或缺的食物，也是中国传统出口产品。其中酱油为最具代表性的一种。酱油的生产工艺主要有天然酿造、酸解、配制等三大类。天然酿造是以大豆或脱脂大豆、小麦或麸皮为主要原料,经微生物天然发酵酿造而成,也就是传统的酱油酿造方法。用此法生产的酱油醇香味美,理论上不存在氯丙醇的问题,但缺点是成本较高、生产周期长。化学酸解法是以脱脂大豆、花生粕、小麦蛋白或玉米蛋白为原料用盐酸水解的方法分解植物原料中的蛋白质,制成酸水解植物蛋白调味液(简称HVP),俗称为“化学酱油”。这种方法成本低、工艺简化、生产周期短、而且鲜味突出、因此不少厂家用此法生产调味品,或在酿造酱油中添加HVP。然而,由于酸水解过程中盐酸不恰当的水解及其他因素的影响就会产生氯丙醇。因此需要采取相应的工艺去除氯丙醇,如果生产条件不具备或生产工艺不过关,生产出的调味品就不可避免地含有氯丙醇。而配制型调味品是指以酿造酱油为主体,与酸水解植物蛋白调味液、食品添加剂等配制而成的液体调味品。因为它含有HVP,因此也有可能含有氯丙醇。从这个意义上说,调味品中是否含有氯丙醇关键在于它是用何种方法生产、生产工艺是否过关。以上3种方法生产出的调味品在色泽、性状和口味等感官性状方面都差不多,名称也没有严格区分,一般消费者难以分辨。按照上述酱油生产工艺,每种都有可能含有有害物质氯丙醇。如果超标,出口的酱油就会遭到欧盟等组织的查封甚至禁止销售,因此,酱油中残留的氯丙醇问题引起了消费者和生产厂家的关注。本文综述氯丙醇的产生、特性、毒性、检测技术及其消除方法。1c7h33coo调味料中的氯丙醇来源于酸植物蛋白水解物(HydrolizedVegetableProteint简称HVP)。生产酸水解植物蛋白调味液,一般采用豆粕或菜籽粕为原料。豆粕内含粗蛋白质45%～51%,粗脂肪0.5%～1.5%;菜籽粕含粗蛋白质33%～37%,粗脂肪1.0%～3.0%。这两种原料中都含有一定量的粗脂肪。因此,在植物蛋白水解的过程中,粗脂肪被酸水解成为脂肪酸和甘油。反应式如下:(C17H33COO)3C3H5+3H2O→3C17H33COOH+C3H5(OH)3甘油分子中有三个羟基在发生化学反应时,可以生产三种衍生物,而且一元和二元的衍生物存在多种结构的异构体,它们都含有一个不对称碳原子,因此,又有旋光异构体存在。甘油与盐酸反应时按下式进行:C3H3(OH)3+HCl→C3H5(OH)2Cl+H2O在甘油与盐酸的反应中,最易发生反应的是第3醇(从右到左),生成3-氯-1,2-丙二醇(3-MCPD),第2醇次之,即生成2-氯-1,3-丙二醇(2-MCPD),最难的是第1醇,难于生成1-氯-2,3-丙二醇(1-MCPD)。在发酵酱油中,酵母菌在发酵过程中能将一部分糖发酵成甘油,虽然有食盐中的氯离子存在,在水量较多的偏酸性溶液中,难于形成氯丙醇衍生物,同时在发酵过程中,甘油又能与有机酸形成酯类化合物,从而减少了游离状态的甘油存在数量。因此,发酵酱油中氯丙醇含量极低甚至没有。综上所述,脂肪是氯丙醇的主要前体物,而生产酸水解植物蛋白所用的豆粕、豆饼、棉子饼、花生饼等原料是油脂生产厂的副产品,其中不可避免地残存油脂,所以氯丙醇的产生是不可避免的。加上酸水解植物蛋白生产厂家追求氨基酸的收得率,投入过量的盐酸,延长水解时间,结果在产生甘油和游离脂肪的同时,又加重了3-MCPD、1,3-二氯-2-丙醇(1,3-DCP);1,2-二氯-1-丙醇(1,2-DCP)。2氯丙醇的特性2.1-氯-1,2-丙二醇3-氯-1,2-丙二醇,英文名为3-monochloro-1,2-propanediol,简写为3-MCPD,其化学结构式为CH2Cl-CHOH-CH2OH。它是一种无色有甜味的液体,凝固点-40℃,沸点213℃(分解),相对密度1.3218(20℃),折射率1.4809(20℃),溶于水、乙醇、乙醚和丙酮,微溶于甲苯,不溶于苯,石油醚和四氯化碳。不稳定,放置后渐变为稻黄色,易吸潮。3-氯-1,2-丙二醇仅属于氯丙醇中的一种衍生物,除此之外,还存在以下多种衍生物,它们通称氯丙醇(chloropropanol)。甘油-氯醇:当氯原子取代不同位置上的一个羟基时,可以形成以下三种不同的化合物:1-氯-2,3-丙二醇(1-MCPD);2-氯-1,3-丙二醇(2-MCPD);3-氯-1,2-丙二醇(3-MCPD)。甘油二氯醇:当甘油分子中有两个羟基被氯原子取代时,可形成以下两种化合物。1,3-二氯-2-丙醇(1,3-DCP);2,3-二氯-1-丙醇(2,3-DCP)。这两种化合物是具有醚样气味的无色液体,它们广泛用于工业加工领域。甘油三氯醇:当甘油分子中有三个羟基都被氯原子取代时,生成的化合物称为1,2,3-三氯丙醇。除了HVP作为氯丙醇的主要原料外,氯丙醇还有三种同分异构体:1-氯-2-丙醇CH3-CHOH-CH2Cl;2-氯-1-丙醇CH3-CHCl-CH2OH;3-氯-1-丙醇CH2Cl-CH2-CH2OH。2.2大鼠尿中化学成分的代谢途径3-MCPD可以通过血睾丸屏障和血脑屏障广泛分布在体液中,其原型化合物通过与谷胱甘肽结合部分脱毒,大约体内30%的3-MCPD可以分解并通过CO2呼出体外。经口摄入的1,3-DCP约有5%以β-氯乳酸盐形式从尿中排出,1%是以2-丙醇-1,3-二巯基丙酸形式排出。另一项试验显示:大鼠尿中含原型化合物3-MCPD以及1,2-丙醇分别达到摄入剂量的2.4%、0.35%和0.43%。Koga等提出在大鼠的代谢途径中,2,3-DCP产生3-MCPD和2-MCPD,1,3-DCP仅仅产生3-MCPD,它们的代谢途径不同可能引起对于器官毒性的不同。Nakamura等报道在某些细菌和大鼠中,在1,3-DCP代谢为3-MCPD的转变过程中形成表氯醇(ECH),而表氯醇可引起雄性生殖系统损伤。3毒性作用经过人们长期研究,发现氯丙醇在多个方面具有毒性从而推测对人体也会存在危害。3.1-mcpd对大鼠肝肾损伤的影响3-MCPD的大鼠经口LD50为150mg/kg。在大鼠和小鼠的亚急性毒性试验中发现,肾脏是3-MCPD的毒性作用靶器官。一项大鼠4周喂养试验表明,在摄入剂量达到30mg/kg/day时,3-MCPD使实验动物肾脏相对重量增加。3-MCPD代谢产物草酸钙晶体沉积于肾小管内膜造成大鼠肾脏损伤,引起大鼠多尿和糖尿。慢性毒性试验发现,大鼠从饮水中摄入3-MCPD后(浓度分别为0.2mg/kg、100mg/kg、200mg/kg),试验组大鼠随着3-MCPD的摄入量增加,肾脏绝对重量显著增加,组织学检验发现有肾小管增生,实验动物3-MCPD染毒剂量与一些器官的良性肿瘤发生率呈正相关。虽然最低剂量试验组(1.1mg/kg/day)肿瘤发生率和对照相比较没有统计学显著差异,但是发现引起肿瘤的3-MCPD摄入剂量远远大于导致肾小管增生的剂量。因此,FAO&WHO联合专家组委员会将1.1mg/kg/day作为可观察肾损伤作用的最低剂量。人类3-MCPD每日最大允许摄入量为2μg/kg。3.2大鼠精子毒性试验早在20世纪70年代,人们发现3-MCPD具有使精子数减少,精子活性降低,并干扰体内性激素平衡而使雄性动物生殖能力减弱的作用。3-MCPD对其他雄性哺乳动物生殖力的影响要比大鼠弱。雄性大鼠连续经口染毒3-MCPD1mg/kg/day以上剂量时,可以出现精子活动减弱和生殖力降低。剂量大于或等于10～20mg/kg/day,可见大鼠的精子有显著的形态学改变和附睾损伤。人们曾将3-MCPD用于生产男性避孕药,但是后来由于其毒副作用而舍弃。3.33-mcpd的体外试验一些体外实验研究认为,3-MCPD经过代谢形成具有基因毒性的中间产物。但是3-MCPD在加S-9或不加S-9的情况下Ames试验均呈阳性。在活化系统存在时,3-MCPD的体外SCE试验也呈阳性。另一体外试验表明3-MCPD具有使M2成纤维细胞株恶性转变的作用。大鼠骨髓微核试验及肝脏UDS试验均未发现3-MCPD的遗传毒性。目前认为体外实验中3-MCPD呈现的遗传毒性,是由3-MCPD和培养基成分发生化学反应生成的产物所致,而不是生物转化的结果。目前大多数研究者认为3-MCPD属于非遗传毒性致癌物。3.4神经毒性改变小鼠和大鼠对3-MCPD的神经毒性作用敏感性相同,尤其是对脑干的对称性损伤。最早的神经毒性改变局限在神经系统胶质细胞中,主要是星状细胞的严重水肿、细胞器严重破坏。当3-MCPD染毒剂量大于25mg/kgbw/day时,实验动物中枢神经系统损伤呈现显著的剂量效应关系。4-氯丙的检测自1999年欧盟国家检出亚洲国家进口的酱油含有超量的可疑致癌物3-氯-1,2-丙二醇,并在有关媒体上公布了不合格的品牌后,我国有关部门和生产厂家给予了高度重视,除了积极研究清除工艺外,对3-氯-1,2-丙二醇的检测技术也进行了积极研究。目前,已有一些比较成熟的方法得到应用。于维森等报道了用色质联用仪快速定性酱油中3-氯-1,2-丙二醇的研究成果。原理是:由氯丙醇理化性质可知,氯丙醇即能溶于水中又能溶于极性较小的乙醚、四氯化碳中,很难用液液萃取方法提取食品内的氯丙醇,尤其是水相中的3-MCPD,因此,一般用固相层析的方法提取。同时由于沸点低,在浓缩时不能蒸干。采用ExtrelutNT20提取样品内的3-氯-1,2-丙二醇,用正己烷-乙醚(9∶1)洗脱脂质组分后,再用乙醚洗脱样品内的3-氯-1,2-丙二醇,残留物用对甲基苯磺酸的丙酮溶液衍生,用选择离子监测的气相色谱-质谱联用方法进行测定。随着质谱技术的发展,质谱技术已逐步发展成为分析确证未知物的有效手段。用化合物的质谱图鉴定组分优于色谱的保留时间,用色谱时间和质谱指纹数据对化合物进行分析,最大限度地保证了分析的可靠性。于维森等所使用的仪器与试剂情况为仪器GCQ气相色谱-质谱联用仪(美国Finnigan-MAT公司);色谱柱:J&W公司DB-μ5ms(30m×0.25mm×0.25μm);旋转蒸发仪;WX-80旋涡振荡器;玻璃层析柱(40cm×20id);恒温水浴箱(100℃)。试剂丙酮;乙醚;正己烷;无水硫酸钠(600℃;活化4h);ExtrelutNT20(Merck公司);饱和氯化钠溶液(5mol/L)。正己烷-乙醚(9∶1);对甲基苯磺酸的丙酮溶液(1mg/mL);3-MCPD标准储备液;3-MCPD中间溶液等。张思群等报道了广州出入境检验检疫局食品实验室对氯丙检测技术的研究情况。1997年底,摸索1,3-二氯丙-2-醇(1,3-DCP)和2,3-二氯丙-1-醇(2,3-DCP)的顶空气相色谱(GC/FID和GC/ECD)的检测方法,检测低限达到0.1mg/kg;1998年上半年,建立了用柱层析净化、GC/ECD测定1,3-DCP、2,3-CDP的方法(不须衍生化),检测低限达到0.05mg/kg;1999年建立了GC/ECD同时检测酱油中1,3-DCP、2,3-DCP和3-MCPD(3-氯丙醇)的方法(衍生化法),先用三氟醋酸酐(TFAA)作衍生试剂,后改用七氟丁酰咪唑(HFBI),检测低限达到0.01mg/kg;1999年下半年,建立了气相色谱/质谱(GC/MS/MS-EI)同时测定酱油中1,3-DCP、2,3-DCP和3-MCPD的方法(衍生化法),分别用TFAA和HFBI作衍生试剂,检测低限达到0.01mg/kg;2001年初研究了GC/MS-PCI、GC/MS-NCI、GC/MS/MS-NCI等测定氯丙醇的方法,建立了GC/MS/MS-NCI测定酱油中1,3-DCP、2,3-DCP和3-MCPD的方法(衍生化法),检测低限达到0.001mg/kg以下。该方法已经通过国家检验检疫总局组织的专家审定,并在实践中得到广泛应用,检测精度很好。5氯丙醇的去除由于氯丙醇的危害,人们开始研究清除方法,目前已有多种工艺可供实际需要,下面介绍一种成熟的工艺。5.1-mcpd反应以丙烯为原料也可以制备甘油,反应式如下:由上式可以看出,1,3-二氯-2-丙醇即CH2Cl-CHOH-CH2Cl在碱性条件下进行加热反应可以生产甘油,这也就是说,上述由油脂水解生成甘油,再与盐酸反应生成3-MCPD的一系列反应是可逆反应。因此,采用30%NaOH溶液将植物蛋白水解后的水解液调到pH7～8,在温度70～75℃的条件下反应2h,将水解液中的3-MCPD含量降至0.1mg/kg以下,是有可能实现逆反应的。其反应机理如下:根据该机理,在实际运用中再采用一些技术措施,就可以使水解植物蛋白液中的氯丙醇含量控制在限量指标内。5.2u3000酸水解植物蛋白应用上述理论,经过试验研究,可以得到如下的清除工艺。将脱脂豆粕和脱脂菜籽粕采用盐酸和添加适量的氯丙醇抑制剂水解12～15h,水解完毕,降温至60℃左右,然后用NaOH或Na2CO3进行中和反应,接着进行碱法处理2h。再按料液的2%加入活性碳,在80～85℃温度条件下保温脱色脱臭30min,经带式过滤机粗滤和板框压滤机精滤后,再进行稳定性处理,最后用蒸发器进行低佛点真空浓缩至氨基酸态氮(以氮计)≥1.0g/100mL,使产品质量符合酸水解植物蛋白调味液SB10338-2000标准。采用上述工艺,实际产品中的3-氯-1,2-丙二醇(3-MCPD)含量可达到≤0.1mg/kg,最低可以达到≤0.05mg/kg,远远低于国家行业标准规定的3-MCPD≤1mg/kg的要求。采用该工艺不仅能确保产品质量,生产成本低,而且为维护人们身心健康,参与国际国内市场竞争也具有重要意义。5.3传统酸水解工艺1992年前英国农业渔业及食品部测定酸水解植物蛋白液中3-MCPD的含量超过100mg/kg的很普遍。经过几年的工艺改进,欧洲产品中3-MCPD的含量明显降低,绝大部分产品只有较低的含量。美国自1998年明确规定3-MCPD含量≤1mg/kg以来,在加工工艺也作了多