植物挥发性次生物质的提取方法

植物挥发性次生物质的提取方法

明确昆虫与植物的关系是找到和有效使用天然抗虫药物的先决条件。植物可以通过释放次生蒸发来避免或减少昆虫的损害。研究植物挥发性次生物质与昆虫的关系已有几十年的历史,近20年来,随着分析手段的提高,化学生态学得到了长足发展,并利用生物技术手段,从根本意义上揭示植物—昆虫关系的趋势。研究与昆虫有关的植物挥发性次生物质的大致流程为:植物挥发物的样品制备→生物测定→活性物质的鉴定→进一步的研究。本文从以上几个方面就已被广为采用及近年来提出的新方法加以综述。1制备样品前处理植物挥发物的提取技术很多借鉴于食品风味化学的研究手段。传统的方法有溶剂提取、水蒸汽蒸馏提取、吸附提取等。然后经过浓缩富集,得到其浓度可以达到仪器检测限的样品。现代提取方法有固相萃取、固相微萃取、超临界流体萃取等,一般可以不经过浓缩,直接进样分析。1.1热脱—传统提取技术使用溶剂提取的关键在于溶剂的选择,可以根据相似相溶的原则选择相应极性的溶剂,也可以使用不同的溶剂逐步萃取。索氏抽提(Soxhletextraction)是较为常用的提取方法,所得的粗提物可以通过短程蒸馏、精制、提纯得样品。溶剂提取的优点在于其装置简单,但难以得到特异性强的样品,并对环境有不同程度的污染。水蒸汽蒸馏提取利用蒸汽形成的负压将样品的挥发性物质带出,比较常用的是水蒸汽蒸馏—同步萃取(simultaneousdistillation-extraction,SDE),挥发性物质在被水蒸汽带出的同时,与另一臂汽化的有机萃取溶剂(一般是乙醚)先进行气相萃取,在冷凝的过程中再液相萃取,然后通过不同的支壁回流到各自容器中,反复地汽化—萃取—回流。用这种方法使用的溶剂量较少,能在相对较短时间内提取大量的挥发性及半挥发性物质。SDE最早由Linkens和Nickerson设计,现在有多种改进装置,已有商品SDE。气相回流提取与此类似。用这些方法提取,一般需氮气保护。分子蒸馏需要至少0.133322Pa(10-3mmHg)真空度及低温环境,缩短挥发性组分从蒸发面到冷凝的“平均自由路程”。利用分子蒸馏可以减少产生杂质的机会。热脱—吸附提取法利用热源破碎植物体内的细胞,把植物体内、体外的挥发物赶出,然后以惰性气体或氮气吹出,由低温冷阱中的溶剂吸附。Birkett等提取黑葡萄抗虫挥发物利用的微波炉辅助法亦属于此类。机械损伤及温度的变化会使植物挥发物的释放发生变化,而上面几种方法需要系统温度发生剧烈的变化,且样品需要粉碎或剪碎,这可能会破坏常温下植物挥发物的组成,并且前两种在不损失样品质量的前提下难以提纯。用以上方法也很难得到植物在被植食昆虫危害时释放的挥发物。吸附法从某种意义上解决了上述问题。此法不需要任何热源,完全在常温下进行,也是现在最常用的方法。吸附法利用特异性吸附剂将挥发性成分吸附,然后再用少量的溶剂洗脱。活性碳是使用较早的吸附剂,它对非极性分子有很强的吸附作用,但不易洗脱。现在用得最多的是网络多孔高分子吸附剂,如PorapakQ(乙基乙烯基苯/二乙烯基苯共聚物),SuperQ,Tenax(2,6-二苯基对氧化次苯醚,有3种,分别为TenaxGC,TenaxTA,TenaxGR),XAD(二乙烯基苯/苯乙烯共聚物,常用的有-4,-7,-9)等,现在已有商品吸附柱。但这些吸附剂在某些溶剂中是可溶的,所以应根据吸附剂选择不同的洗脱溶剂,常用的洗脱溶剂有正己烷、乙醚、二氯甲烷等。使用动态吸附的气流应为洁净的稳定气体,最好是惰性气体,以防止某些组分被氧化,如果使用空气,需先经过活性碳等净化后(有的还需调节湿度),再进入放置样品的缸体。利用吸附法可以提取植物活体状态下的挥发物,但不排除非目标挥发物也被吸附剂吸附的可能,这些挥发物可能来自空气、土壤或培养液。Turlings等提取玉米挥发物时,采取控流措施,使缸体进气流量大于吸附管出气流量,多出的一部分气流把可能从缸体底座反吸的气流推出缸体,以保证吸附剂吸附的气体来自植株本身。吸附法可以用于研究植物在某一时间序列内挥发物释放的变化及诱导性挥发物的形成。植物挥发性物质是微量的混合物质,溶剂背景是影响鉴定的重要因素。所以提取过程中所用的溶剂需要重蒸精制。如果不需要对提取挥发物进行全化学指纹定量(即不能用归一化法定量时),则应在溶剂中加入内标。提取过程中所用的容器为玻璃介质,连接管最好使用Teflon管(可用聚四氟乙烯代替),或硅胶管。1.2催化蒸浓缩法法如果提取使用的溶剂量较大,所得的样品则需要浓缩,至少去掉大部分的溶剂,以达到仪器可检测的浓度范围。浓缩之前需除去样品内的水,通常的方法是在样品中加入脱水剂,如无水硫酸钠、无水硫酸镁等,并置于低温环境过夜。减压浓缩可以降低溶剂的蒸馏温度,加快浓缩速度,它的缺点是容易丧失与溶剂沸点相近的植物挥发性组分。常用的减压浓缩装置有K-D瓶(即三球浓缩仪)、旋转蒸发仪。浓缩过程中可以通氮气保护。可以利用吸附剂浓缩。当粗提物经过吸附剂时,微量挥发性物质被吸附,溶剂及某些杂质流走,然后用少量溶剂将挥发性物质洗出。这种吸附浓缩以及上述的吸附法收集都属于固相萃取(solidphaseextraction)的范畴。也可以用氮气(也有用空气)快速吹走样品内的溶剂,或在顶空吹氮保护的条件下自然浓缩。1.3固相微萃取法俞惟乐等在《毛细管气相色谱和分离分析新技术》一书中对现代提取技术进行了详细的综述。用于植物挥发物提取的新技术有固相萃取、固相微萃取、超临界流体萃取等。固相微萃取(solidphasemicro-extraction,SPME)是用一根熔融的石英纤维,它的表层涂有特异性涂层,如聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane),在提取过程中,它被手柄推出保护针,植物挥发物在植物表面、顶空(headspace)以及纤维涂层达到平衡,然后将石英纤维直接注入气相色谱的进样口,吸附在其表层的挥发物在瞬时高温条件下快速解吸附,进入色谱柱分离。用固相微萃取提取挥发物耗时短,且吸附量的检测极限可低达10-12,并且可以得到线性较好的结果。由于无需溶剂,鉴定时没有溶剂的影响,而且提取成本相对较低,利于快速取样分析。Supelco公司已将SPME商品化,并得到广泛使用。Core等利用超临界流体萃取提取了Medicago7个亚种的挥发性物质。超临界流体萃取(supercriticalfluidextraction,SFE)一般采用CO2作为提取溶剂,当处于临界温度、临界压力以上时,它不会液化,但也非气态,而是以一种高扩散度、低粘度的超临界流体状态存在。超临界流体能以高蒸汽压将挥发物快速地从样品中蒸发分离,超临界流体的密度大于正常气体,可以溶解挥发性物质。这种方法有提取快、不破坏挥发性成分、得率高、少污染、后处理简单等优点,但对设备要求较高,它主要运用于工业生产。目前已经有了试验室用的SFE。2生物测定方法2.1多通管昆虫工具利用“通管”嗅觉仪,可以测定昆虫对挥发物的趋性行为,包括昆虫的取向选择以及其对某种挥发物质的响应时间。有关“通管”的类型、样图在杜家纬著《昆虫信息素及其应用》一书中有详细的介绍。这类嗅觉仪大至分为“I”型两通管(单刺激源)、“Y”型三通管(双刺激源)以及多通管(多刺激源)。这几种嗅觉仪有一臂接虫笼,另几臂接挥发性物质刺激源。测定时,气流由刺激源臂流向虫笼臂。昆虫接受刺激逆风爬行或不响应。使用的气流亦需先经过净化。刺激源可以是活体植物、挥发性粗提物、挥发物单体、植物—植食昆虫复合体等,根据需要选择。提取物或挥发物单体的载体一般为滤纸,为保证它们能在长时间内稳定地挥发,可以用医用毛细管作为载体。容易出现的问题是响应时间难以估计,对于较大的昆虫还可能会有空间的限制,可以采用较大的玻璃缸体代替虫笼臂,缸体四周有对称的开口与刺激源臂相通,缸体中心有开口以供抽气,将各刺激源臂中的挥发物吸入缸体。丁红建等设计的四臂嗅觉仪使用了红外录像设备,可以标定包括夜出性昆虫在内的活动节率。风洞是研究昆虫性信息素的常用手段,近年来在植物—昆虫关系的研究中也有应用,它可较大程度地模拟室外真实环境,能系统地研究昆虫对植物挥发物的行为反应。2.2感觉系统elica触角的嗅觉感受细胞在接受有效刺激后,细胞膜通透性发生变化,因而导致膜内外电势差的变化。利用电生理记录仪将电势差变化记录、放大并加以比较,可以确认挥发物对昆虫嗅觉的刺激是否有效,进而寻找有电生理活性的挥发性组分。有关电生理在昆虫嗅觉反应研究的历史及发展参见文献。测定时,参考电极插入(触角)嗅觉感器,记录电极套在嗅觉感器的顶端。电极由玻璃拉制而成,内部充满相应的电生理缓冲液,并通有更细的金属电极(如银—氯化银)。EAG(electroantennography)记录的是触角某一(几)类嗅觉感器全细胞或全触角电位的变化,采用的电极一般为毛细管玻璃电极。SCR(singlecellrecording)可以记录感受细胞单细胞电位的变化,使用的电极是更细的玻璃微电极。用于EAG测定的昆虫大多为鳞翅目等触角较大的昆虫。SCR从原理上可以突破昆虫大小的限制,同时也能在EAG研究的基础上进一步揭示昆虫嗅觉反应的本质。与普通嗅觉仪相比,通过测定嗅觉感受细胞电位来寻找活性成分的效率要高,并且花费相对较低,但它并不是寻找活性成分的终极手段。昆虫对挥发物质的响应是一个比较复杂的过程,EAG反应与普通取向选择反应相矛盾的现象也有报道,结合宏观和微观生物测定才能更有效地解释昆虫对挥发物的反应行为。3gc-ms-ir通常用气相色谱—质谱联用(GC-MS)来鉴定植物挥发物。利用事先在毛细管气相色谱上摸索的色谱条件,先由GC将挥发物馏分分开,流出色谱柱后进入质谱,质谱的离子碎片信号由计算机采集,扫描可检测的有效峰,通过自带的谱库,得出可能的鉴定结果。GC-MS使用的色谱柱最好与探索色谱条件的色谱柱一致,用于同类研究的色谱柱基本都是毛细管柱。利用GC-MS鉴定植物挥发物化学指纹的有效性与质谱的精度及其所带的谱库的大小有很大关系,所以MS并不能直接鉴定所有物质精确的空间结构,而且有研究表明昆虫对不同构型的同类挥发性组分有不同响应,所以GC-MS得出的挥发物全化学指纹并没有完全显示挥发物的全貌。作为GC-MS的延伸,气—质—红外三联(GC-MS-IR)可以将MS流出的组分做进一步分析。如果有必要得到更完善的结果或需要进一步研究,还可以利用其它辅助手段。一方面,可以使用制备用气相色谱或柱层析将粗提物分开为多段的“粗馏分”(前者需要超低温冷阱)。由于每个“粗馏分”的组成比全粗提物简单且相互不同,从而易于选择不同极性的、不同手性的色谱柱进行分析,以在GC上更好地分离。另一方面,如果可以分离到单一的有意义的特异组分,可以进一步利用核磁共振(NMR)、红外吸收、紫外(UV)等波谱分析手段定性。如果只检测某种(些)特异组分的含量或有使用相同条件所得到的参考色谱峰,(可以以高效为前提)利用GC积分仪或工作站标定这些峰的保留时间来定性,或者直接采取外标法定性。用于挥发物研究的GC检测器多为氢火焰离子检测器(FID)。在线分析(online-analysis)是将自动取样和鉴定融为一体的检测手段。由于取样时间短,自动化程度高,减少了其它方法中人为因素造成的影响,易于分析活体植物挥发性气味及挥发性成分在时间上的动态变化,得到的结果与实际情况更相符合。这种方法的关键在于取样和进样,Ruther等设计的一种在线分析方法使用的是顶空取样,以六通阀控制取样系统和进样系统。取样时,冷阱与样品室相通,获得流自样品室的气体;进样时,六通阀将冷阱与GC进样口相通,把冷阱内的样品送入GC-MS分析。4gc-eag-scr法衡量活性的标准由生物活性测定而定。如果在鉴定后逐一筛选标样,不仅工作量大,而且花费也较大。可以先制备上述“粗馏分”,然后将各馏分进行生物测定,鉴定有活性的馏分,再做进一步的生物测定。如果“粗馏分”制备有效,可以节省人力、财力。通过气相色谱分离,利用电生理仪测定可以进一步提高工作效率,组分从GC毛细管柱流出后分流,一部分进入FID,记录下色谱信号,另一部分进入EAG或SCR,信号与色谱信号同步记录到色谱及电生理记录仪上。同时用冷阱逐一收集有电生理活性的馏分,即待检的活性组分。也可采用在线的GC-EAG分析寻找有EAG活性的组分,如SPME-GC-EAG。挥发物是微量的复杂混合物质,越来越多的研究表明,昆虫有趋性反应或者有电生理活性的组分不止一种,作物品种的挥发物在成分和浓度上的差异就会导致品种表现是抗虫还是感虫。所以确定挥发物的有效成分需要做大量的工作。5挥发油的诱导植食昆虫诱导的挥发物(herbivore-inducedvola