全蝎毒活性成分分离及生物镇痛研究

全蝎毒活性成分分离及生物镇痛研究

所有蝎子都是动物东亚蝎子的干燥体，属于真菌病，毒性。具有熄风镇痉,攻毒散结,通络止痛之功效。临床用于治疗惊风、抽搐痉挛、中风口渴、半身不遂、破伤风、风湿麻痹、偏正头痛、疮疡、瘰疬等。随着国内外生物医药学、生物化学及分子生物学的发展,全蝎及其蝎毒素的应用不断拓宽,已成为治疗多种疑难病的临床药物。现将其有效化学成分及作用的研究综述如下。1svc-成分韩雪飞等改进传统两步色谱法,利用SephadexG-50超长柱(长180cm,内径4.5cm)一步色谱法从粗蝎毒中成功地分离纯化了镇痛活性肽“SVC-Ⅳ”。经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,“SVC-Ⅳ”呈现出单一条带,分子量为8500~9000Da,热稳定性好。临床验证对多种急、慢性疼痛均有较强抑制作用,且具有较好的修复受损神经的功效。蝎尾的镇痛和毒性作用与宏量和微量元素含量无关。全蝎蝎毒作为主要有效成分,其蛋白质BmKAngM1是从全蝎分离出来的一种具有镇痛效果的粗肽类,但由于其在粗制蝎毒液中含量很低,限制了它的镇痛特性。对其进一步纯化,先通过镍亲和色谱,接着用RP-HPLC再次纯化,得到了rBmKAngM1,通过ESI-MS(电喷雾质谱)测其分子量为7240Da,生物镇痛效果和BmKAngM1相近。2抗凝活性成分彭延古等采用薄层色谱法和纸色谱法对全蝎抗凝活性成分进行鉴定和分析,全蝎抗凝活性成分中无生物碱、糖类、甾体和萜类存在,双缩脲反应法显示为蛋白质和多肽物质。用含0.3%的茚三酮为显色剂,正丁醇∶乙酸∶冰醋酸∶水(4∶1∶1∶2)作展开剂,首次从供试品中分离得到6个不同组分的斑点,样品与对照品展开时的氨基酸Rf值非常接近,故推测全蝎中可能存在天冬氨酸、赖氨酸、甘氨酸、酪氨酸等14种氨基酸。氨基酸没有抗凝活性,但是含有氨基酸基团的多肽有抗凝活性。全蝎提取液对双氧水(H2O2)损伤血管内膜致家兔动脉血栓形成的试验结果以血栓/血管重量比表示。全蝎组血栓重量明显较生理盐水组低,生理盐水组为(2.1±1.2)mg/mg,全蝎组为(0.8±0.2)mg/mg,两者相比差异有统计学意义(P<0.01);而两组的PLT造模前后差异无统计学意义(P>0.05);全蝎液提取物能明显延长APTT、PT、TT,表明全蝎液对内源性及外源性凝血均有抑制作用。抗凝活性成分的提取中,以紫外分光光度法测其抗凝蛋白含量,全蝎提取液的凝血酶时间与蛋白质含量成正相关(r=0.9988)。全蝎提取液的活性易受pH的影响,其经过酸碱处理后,全蝎提取液的凝血酶时间与原药液相比有所降低,凝血酶时间为空白组:(18.1±0.7)s;药液对照组:(51.2±2.0)s;酸处理组:(39.4±4.0)s;碱处理组:(46.1±3.1)s;同浓度盐对照组:(42.8±2.4)s。酸碱处理后药液活性与同浓度盐溶液相比差异无统计学意义(P>0.05),但和药液对照相比活性有所降低(P<0.05)。这可能是经过酸碱处理后,由于蛋白质水解作用,使其抗凝蛋白含量下降,但与冻融的次数无关。全蝎提取液随着加热时间的延长,特别是在加热5min以后,其抗凝活性逐渐降低。全蝎还含有Ca、Mg及Fe、Cu、Zn、Mn、Pb等多种微量元素,雄性全蝎各药用部位宏量和微量元素明显低于雌性全蝎,这些微量元素的存在可能影响全蝎毒蛋白结构,从而影响全蝎的抗凝活性。3全蟹毒素的来源氯毒素是全蝎毒素中一个很重要的毒素,它特定地结合在重组氯毒素(rBmKCTa)细胞表面,作为氯通道的阻断剂。通过进一步纯化从全蝎中分离出rBmKCTa,并显示其人的神经胶质瘤的临床治疗方面可能有潜在的治疗作用。另外也发现有一种毒素(BotLVP1)影响钠通道,但其作用机制还不是很清楚。迄今为止,已经从蝎毒中分离出数十种蝎毒素单体。其中有一种为HS-1,它是从粗全蝎毒液中纯化而来的,纯化部分通过SDS显示为单一带,MALDI-TOF-MS/MS分析显示了为蛋白质一个峰其分子量为8293Da,其部分氨基酸序列显示了高同源性,归属于全蝎多缩氨酸中的钾渠道阻断家族。O-cholaJB等通过CE(毛细管电泳)和RP-HPLC分离了全蝎3种毒肽类,分别为鳞翅目昆虫-选择性的毒素(P.leiosomainsecttoxin,Plit)、P.leiosomaPlt毒素、P.leisomamammal-selectivetoxin,Plmt.,PetricevichVL等使蝎子毒液通过SephadexG-50收集洗脱液,发现洗脱液II对巨噬细胞有作用,命名该物质为Ts1,代表T.serrulatusvenom1,并阐明Ts1对巨噬细胞有一个重要的免疫调节作用。4离抗癫痫肽方面的研究刘崇铭等研究了河北产钳蝎蝎毒及抗癫瘸肽(AEP)对咖啡因、美解眠、士的宁诱发的三种小鼠惊厥模型的作用,并与安定进行了比较。结果显示其有很好的抗癫痫作用,在快速分离抗癫痫肽方面有很大的进展。边六交等通过高压阳离子交换和凝胶排阻色谱柱蝎毒毒中分离出纯化抗癫痫肽(AEP分子量为8300Da)。在通过高压阳离子交换色谱图中,将色谱图峰分为3个组,并发现第一组峰中,仅峰三能够显著延长用马桑内酯诱发的惊厥SD大鼠的癫痫发作时间(39.2±4.2)s,生理盐水组为(10.2±1.6)s,将峰三收集液在高压凝胶排阻色谱上进一步分离,分离成为两个峰,并发现约18min处的峰具有抗癫痫活性,其在Shim-packVP-ODS反相色谱柱上的纯度约98%。5保肝作用下多次克氏原螯虾体内脂肪酸鲜全蝎含有蝎毒(Buthotoxin)、三甲胺、甜菜碱、硫磺酸、棕榈酸、软硬脂酸、胆甾醇及铵盐、卵磷脂,还含有苦味酸赅(为与蝎毒同存于毒腺中的柱状苦味酸盐),主要由蛋白质和非蛋白质两部分组成。蝎毒素是一类由20~80个氨基酸组成的含有C、H、0、N、S等元素的毒性蛋白,毒素有很高的专一性,含硫量高,分子量在6000~9000Da之间,但也有3000Da左右或大于10000Da。蝎毒素的分子结构中含有3~4对二硫键,其中3对构成环状核心结构,对于保持稳定性、发挥神经毒性有重要意义。蝎子油中含有棕榈酸甲酸(CI7H34O2,35.1%)、硬脂酸甲酸(C19H38O2,26.6%)、油酸甲酯(C19H35O2,25.3%)等脂肪酸,是以饱和脂肪酸为主的酸性成分。全蝎蝎毒作为主要有效成分,具有蛋白质通性,水溶液可被乙醇、硫酸铵或氯化钠浓溶液沉淀、分离、沉淀再溶于水,产生可逆沉淀反应,而强无机酸或碱、乙醚等有机溶剂等作用,则产生不可逆沉淀反应即变性。蝎毒水溶液100℃加热30min即被破坏。朱心强等报道新鲜蝎毒隔水煮沸30min其毒性基本未见破坏,即使煮沸120min,其LD50仅升高1倍左右,仍有明显的毒性。孔天翰等发现:在一特定温度下,随着加热时间延长,280nm波长处的吸光度呈线性升高,值得注意的是在同一加热时间内,50℃至70℃加热时的吸光度基本呈上升趋势,如继续加温至80℃,则吸光度反而略有下降,其数值与50℃较为接近。并且认为蝎毒及其注射剂较蜂毒注射剂更为耐热,常压下高温煮沸不易破坏。根据已测定的蝎毒素的构象来看,分子结构含有3~4对二硫键,可能较一般的蛋白质稳定。M,OtsukiJ等通过液相和质谱从全蝎毒液中检测了超过200多种化合物(分子量范围从500到5000Da),一个含有大量单同位素分子为7781.6Da和四座二硫化物桥梁的肽类也从全蝎液中分离出来。Kozminsky-AtiasA等从蝎子毒液中分离纯化了BoiTx1,并研究了它的活性和结构,指出BoiTx1是由37个氨基酸组成的长肽,包含有6个半胱氨酸。BoiTx1归属于alpha-KTx3.10毒素。其药理学作用在Xenopuslaevisooc