egcg对人胰腺癌细胞panc-1增殖的影响

egcg对人胰腺癌细胞panc-1增殖的影响

目前，许多胰腺患者的治疗时间属于晚期，手术切除率低，能够手术切除的患者的随访率高。胰腺癌的低切除率和高复发率决定了化疗在胰腺癌的综合治疗中仍有重要地位,但胰腺癌的化疗效果并不理想,其主要原因归结于胰腺癌是天然耐药的肿瘤之一。缺氧是实体肿瘤内普遍存在的现象,肿瘤的缺氧微环境是肿瘤细胞发生耐药、恶性转化甚至转移的始动因素。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是绿茶中的主要成分,同时也是抗肿瘤作用的活性成分,能在转录后水平和翻译水平阻断缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达,抑制HIF-1α在肿瘤中的转录活性,进而发挥其抑制肿瘤细胞增殖的作用。本研究拟选取人胰腺癌PANC-1细胞系,通过给予不同剂量的EGCG,观察其对胰腺癌PANC-1细胞增殖的影响,从而为探讨逆转胰腺癌多药耐药的可行性奠定分子学基础。1材料和方法1.1材料和试剂1.1.1细胞人胰腺癌PANC-1细胞株来自美国ATCC人胰腺癌株PANC-1(ATCCnumber:CRL-1469),由本所引进。1.1.2胎牛和cck-8试剂DMEM高糖培养基购自Gibco公司。胎牛血清购自中国杭州四季青公司。CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所。EGCG购自浙江一新制药股份有限公司。1.2实验方法1.2.1普通co培养模式常氧培养胰腺癌PANC-1细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基,另添加抗生素(100U/mL青霉素和100mg/L链霉素),置于37℃、5%CO2、饱和湿度的普通CO2培养箱内培养。缺氧培养:将细胞置于1%O2、5%CO2、94%N2、37℃、饱和湿度的三气培养箱中培养。待细胞生长达对数生长期时,用0.25%胰蛋白酶消化,传代接种于100mL的细胞培养瓶中。每瓶细胞密度为2×105mL,每瓶加入2mL培养基。1.2.2细胞充质ecgg取对数生长期的PANC-1细胞制成单细胞悬液,按每孔1×104个细胞接种于3个96孔板中(每孔100μL),置于37℃、含5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养24h,待细胞贴壁生长融合至80%时,分别加入终浓度为10、20、40、60、80、100、160μg/mL的EGCG,每一浓度设3个复孔,以不含EGCG培养基的细胞作为阴性对照,为空白孔调零。细胞转置37℃、含1%O2、5%CO2和95%N2饱和湿度的缺氧培养箱中持续缺氧培养12、24、48h。分别缺氧培养12、24、48h后拿出96孔板在酶标仪475nm处测定各孔的吸光值(A)。按以下公式计算抑制率:抑制率(%)=[1-(实验组平均A值-调零组平均A值)]/(对照组平均A值-调零组平均A值)×100%。1.3统计学处理ss所有实验数据均以均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示,以SPSS17.0统计软件进行t检验和单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。2panc-1细胞增殖抑制作用EGCG对PANC-1细胞增殖的影响:CCK-8结果显示,不同浓度的EGCG(10、20、40、60、80、100、160μg/mL)均能有效抑制PANC-1细胞的增殖,且其抑制作用呈现出明显的剂量依赖性;并随着作用时间的延长其抑制作用显著增强,呈现出明显的时间依赖性(见图1、表1)。160μg/mLEGCG作用48h后,PANC-1细胞的生长抑制率高达(91.03±2.32)%。3氧防治肿瘤的作用机制多药耐药(MDR)是指在肿瘤化疗中细胞对于一种化疗药物产生耐受后,同时对其他同一或非同一类型的化疗药物也产生耐药性。MDR最早是在肿瘤化疗中发现的,通常被描述为在细胞功能和结构这两个不相关方面的同步的耐药抵抗。美国癌症协会曾经统计过,大约90%以上肿瘤病人的死亡在不同程度上与耐药性有关。而胰腺癌化疗效果不佳的原因是多方面的,包括局部的药代动力学、血胰屏障以及胰腺癌细胞对化疗药物的天然耐药性等,最主要的原因还应该归咎于肿瘤细胞的耐药性。实验证明与其他肿瘤相比,体外培养胰腺癌细胞对目前常用化疗药物的敏感性较差。40例胰腺癌细胞中仅有4例(10%)筛选到抑制率大于85%的药物,各药物的平均抑制率也明显低于同期实验中的胃癌。氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素、长春地辛、羟基喜树碱、依托泊甙、顺铂、表阿霉素、吡柔比星和健择10种化疗药物中,平均抑制率>40%的药物仅有丝裂霉素、健择和5-氟尿嘧啶,并且与其他药物比较未发现有统计学差异。这说明胰腺癌化疗效果不佳与其天然的耐药性有关。低氧导致肿瘤细胞耐药的机制较为复杂,主要有以下几方面:①实体瘤内血管结构和功能的异常,使肿瘤组织坏死出血形成血栓,血流不畅,药物不易到达肿瘤内部,从而不能达到抗肿瘤的效果。②低氧能抑制肿瘤细胞增殖。体外低氧处理能特异性地抑制S期细胞DNA复制的启动,表现为细胞增殖率随血管距离的增大而减少,而大多数抗肿瘤药物主要作用于快速分裂期的细胞,故低氧导致肿瘤细胞对抗肿瘤药物敏感性下降。③缺氧组织细胞pH值的变化(低氧组织中pH值约为7.05,正常值约为7.3),可影响抗癌药的细胞内外分布。④缺氧使多药耐药基因表达增加。⑤低氧是肿瘤发生恶性转化甚至转移的启动因子。低氧通过诱发肿瘤细胞的遗传不稳定性、筛选丧失凋亡潜力的肿瘤细胞及诱导多种参与肿瘤细胞恶性转化的基因和蛋白的表达,使肿瘤细胞发生恶性转化,这些发生恶性转化的肿瘤细胞极易通过缺氧诱生的肿瘤新生血管而发生远处转移。肿瘤恶性转化甚至转移使抗肿瘤药物敏感性降低。目前,很多化疗药物在杀灭肿瘤细胞的同时,也损害了大量正常细胞,有很强的毒副作用。化疗药物的毒副作用和肿瘤细胞的耐药性一样都是肿瘤治疗中难以解决的问题。研发特异性攻击肿瘤细胞、逆转肿瘤细胞耐药性的新型抗肿瘤药物必然是解决问题的最佳方法。众所周知,天然物质具有毒性小等特点,所以从天然物质中筛选和分离抗肿瘤的有效成分,寻找肿瘤细胞凋亡诱导剂已成为当前肿瘤学的研究热点。茶作为天然植物,其抗肿瘤作用的研究一直是肿瘤防治领域的热点。茶叶是富含多酚类的化合物,包括黄烷醇、黄酮类和茶多酚类,其中大部分为黄烷醇,通称儿茶素。绿茶中主要的儿茶素有:表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素(EC)等,其中EGCG含量最高,占儿茶素的80%。许多学者认为它是抗肿瘤作用的主要活性成分,自1987年Fujiki等最早报道EGCG抑制人体癌细胞以来,许多国家大量的研究报道揭示了茶的抗癌活性及其机理,包括了体外研究、体内研究、临床试验和流行病学调查等各个阶段,它们证明了茶叶对各种动物癌症,包括皮肤癌、肺癌、口腔癌、胃癌、小肠癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、直肠癌、前列腺癌等,都有明显的预防和治疗效果。并且Ullmann等通过给予健康志愿者50～1600mg不同剂量的EGCG,来检查其安全性、可耐受性及药物代谢动力学。结果显示:即使EGCG给药剂量达到1600mg时,志愿者仍然可以较好耐受。本研究为克服MTT的不足,选用新的检测方法Count-ingKit-8(简称CCK-8)法检测细胞的增殖情况。CCK-8法的检测原理与常规MTT法略有差异,检测条件也不尽相同,试剂经活细胞线粒体脱氢酶转化后形成水溶性结晶,可直接进行比色,实验误差较小。检测结果显示,不同浓度的EGCG(10、20、40、60、80、100、160μg/mL)在缺氧条件下均能有效抑制PANC-1细胞的增殖,且其抑制作用呈现出明显的剂量依赖性;并随