2023犬细小病毒病诊断技术

犬细小病毒病诊断技术PAGEPAGE8犬细小病毒病诊断技术范围本文件规定了犬细小病毒病的临床检查、血凝与血凝抑制试验、PCR检测、荧光定量PCR、胶体金试纸检测的操作方法。PCR检测、荧光定量PCR（GB/T6682 NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范本文件没有需要界定的术语和定义。GB/T6682FK81细胞(。0.9%AA.1。1%AA.2。Taq10倍TaqTaq5U/μL，-20℃保存。1.5mLEppendorf0.2mLPCRdNTP：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP10mmol/L，-2010%A。AA.4。AA.6。Premix。PCR仪412000gPCR140或6.2.26.3.1或6.3.3PCR(HA)除了特别规定外，本文件中涉及到的样品采集及处理操作方法符合NY/T541兽医诊断样品采3000g15min在96孔“v”100501.5mLEppendorf50至第至第31150孔1:22孔1:43孔1:8……121%5015min~30100%凝集()HA在96孔“v”1050和124CPV第150μL50至第1101孔1:22孔1:43孔1:8……由第1150μL，4125037PCR7.1。CPVDNA46525μL10%10的20mg/mL蛋白酶h500μL20s，12000g5min(25:24:1)205醇205g1050DNADNAPCR引物：浓度为20μmol/L其序列如下：上游引物(CPVF)：5'GAATCTGCTACTCAGCCACCAAC3'；下游引物(CPVR)：5'GTGCACTATAACCAACCTCAGC3'。在0.2mLPCR10Taq250.5酶0.5模板2(CPVF、CPVR)各0.518.5μLPCRPCRPCR94℃变性2303040进行353。用TBE1.5%(0.5μg/mLEB)AA.710μLPCRA中A.8DNA5V/cm电泳约30minPCR609bp8.4.1609bp609bp荧光定量PCR操作步骤同8.1。采用TaqMan探针法。VP1-F:5'-GACAATCTTGCACCAATGAG-3'；VP1-R:5'-CCAGATCCTGTAGCTCTTTC-3'VP1-P:5’-(FAM)TGGAGCAGTTCAACCAGACGG(BHQ)-3’DNA操作步骤同8.2。实时荧光定量PCR检测在0.2PR薄壁管中按每个样品PexxaPbePCR（X10L、A模板5L、10pmol/µL）0.50.53.5µL检测体系。将PCR管置荧光定量PCR953min，9510s，6030s，45阴性对照无Ct阳性对照的Ct35S无Ct值或Ct值>40，并且无特定扩增曲线，表明犬细小病毒核酸阴性｡Ct值≤40，且出现特定的S型扩增曲线，表明犬细小病毒核酸阳性。Ct值大于35.0的样本为弱阳性样本，需排除样本或产物污染的可能。如需复核，建议重提核酸复核。对于Ct40Ct值≤40—1010.1.23～4（80～120110～20min30min（C）（T）（C）（C）（T）1、910符合标准临床症状符合6.2.1或6.2.2且出现6.3.1或6.3.3的病理变化，其他临床症状和病理变化可作78、9、106（7、、9106（10A.10.9%生理盐水

附录A（资料性附录）试剂及其配制称取9g无水氯化钠溶于1000mL去离子水中配成0.9%生理盐水，121.3℃灭菌15min。1%1mL新鲜肝素抗凝猪血加入9mL灭菌生理盐水制备而成。制备好后最好立即使用。暂时不用可放置4℃冰箱保存。CPVCPV接种FK81细胞，培养3d~5d，当病变达60%~80%时收获，冻融三次或超声波处理后，低速离心去除细胞碎片，上清液分装后低温保存。10%(SDS)在90mL三蒸水中溶解10g十二烷基硫酸钠(电泳级)，加热至60℃助溶，用盐酸调pH值至7.8，加三蒸水定容至100mL。贮备液(20mg/mL)每升三蒸水中加入三羟甲基氨基甲烷(Tris)1.21mg，乙二胺四乙酸(EDTA)1.86mg，十二烷基硫酸钠(SDS)5g，用盐酸调pH值至7.8。取该溶液按每毫升加入20mg蛋白酶K，充分溶解后分装。每升三蒸水中加入三羟甲基氨基甲烷(Tris)54.0g，乙二胺四乙酸(EDTA)2.9mg，硼酸27.5g，用5