富营养化湖泊蓝藻水华的生态治理

富营养化湖泊蓝藻水华的生态治理

随着城市和工业的发展以及农业化肥的大量使用，已处理的城市生活废水和工农业废水直接排入湖泊和河流，导致氮、磷等养分积累，并大量繁殖低级水生生物，如兰藻和其他水生生物，形成“水花”。水华的发生导致水体透明度下降,水质恶化,产生异味,对湖泊(水库)的多种用水功能(饮用、水产养殖等)和观赏功能造成严重损害。很多水华藻类(如水华鱼腥藻)能够固氮,导致水体的富营养化进程加速发展。国内营养化湖泊类型中,蓝藻型富营养化为典型代表,如巢湖、太湖、滇池和南京的玄武湖等。这些湖泊水华暴发期间,铜绿微囊藻是滇池水华的绝对优势种。铜绿微囊藻含有肝毒素,对人类健康存在潜在危害。近几年来,中央和地方为治理富营养化湖泊蓝藻水华投入了大量资金,滇池耗资40亿,太湖耗资100个亿,一些小型城市湖泊的治理也是动辄上亿元。采用了控制污染源、底泥疏浚、氧化沟技术、直接打捞藻华、生化综合除藻法,以及利用大型水生植物吸收营养盐来控制富营养化等多种方法,这些措施在一定程度上缓解了营养盐的人为增加引起的富营养化,但对水华的控制都没有取得令人满意的效果。蓝藻水华是一个典型的生态问题,生态问题只能用生态学方法去解决。控制和治理藻华的关键是找到一种能够直接有效杀死或者抑制藻类生长的因子,经济而便于大规模使用,而且不会造成二次污染。使用化学杀藻剂虽然可以在一段时期内有效的控制水华,但是价格昂贵,而且可能产生二次污染。即使化学杀藻剂不快速产生负面影响,也会增加湖泊底泥中有害物质的浓度。而生物控藻因子(主要是微生物制剂)则不会产生类似问题,是一种很有前景的控藻因子。1控藻因子的应用自然界中有很多生物都可以抑制藻类的生长,它们主要包括:蓝藻病毒(噬藻体)、溶藻细菌、原生动物、真菌和放线菌。它们直接分离于自然界,因此使用这些生物控藻,不会像营养源控制(下行调控)和“生物操纵”(Biomanipulation)那样对湖泊生态系统产生根本的改变。它们适合在水华发生初期使用,短期内控制藻类生物量或者阻止藻类大量增殖。原生动物是水生食物链中的重要环节,很多原生动物可以取食藻类,有些甚至以藻类为惟一食物。在湖泊和海洋水生态系统中,藻类生物量的下降往往伴随着原生动物数量的急剧增加。比较各种控藻生物因子的环境适应力、繁殖能力、控藻效力、宿主范围、对宿主改变的适应能力以及不利环境下的抗逆性等多种因素,人们认为原生动物是一种很有实用前景的控藻因子。原生动物作为控藻因子有以下优势:(1)原生动物取食范围广。已经分离到取食微囊藻、鱼腥藻、束丝藻等滇池优势藻种的原生动物。(2)原生动物食量大,实验室中观测到,只要原生动物数目达到某一阀值,体系中的藻细胞会被迅速消耗殆尽。(3)很多原生动物在食物耗尽时会形成包囊,度过食物缺乏期。当藻类重新增多时,包囊又会破壁复苏成为食藻营养体。(4)包囊结构具有很强的抗逆性,这种形式容易包装和运输。(5)容易繁殖。原生动物可以利用有机培养基大量发酵培养。2海藻原生动物的科学研究食藻原生动物主要分为:鞭毛虫、变形虫和纤毛虫三个大类,下面将对三大类的主要食藻种类以及研究情况作简单的介绍。2.1微生物细胞的生长目前报道的食藻鞭毛虫主要属于金滴虫目(Chrysomonadida),特别是其中的棕鞭毛虫(Ochromonas)。1973年,Daley等人在开放体系中培养蓝藻时,发现了一种引起组囊藻(Anacystisnidulans)死亡的污染物,将少量的污染物接种到纯培养的组囊藻藻液中,会在6—24h内将藻细胞生物量降至极低水平,同时体系中Ochromonas大量繁殖。进一步研究发现,组囊藻藻细胞的消失是由于Ochromonas的吞食作用,并不是由于相关的细菌或者鞭毛虫释放的溶藻性物质。通过透射电镜,还在Ochromonas的食物泡中发现了处于不同消化时期的组囊藻细胞。同时Prows和McIlhenny还报道了四种可以取食铜绿微囊藻的Ochromonas,分别是:Och.Bastrop、Och.ovalis、Och.malhammensisi和Och.danica。他们用电子显微镜和细胞化学等方法研究Ochromonas对蓝藻细胞的吞食和消化,他们发现当Ochromonas吃进足够多的微囊藻细胞之后,身体由叶片状变成圆球状。2.2吸食藻类种类对湖泊水华的影响早在1897年,Leidy就报道了Amoebaradiosa,A.verrucosa和A.proteus等变形虫取食“蓝绿藻”(Blue-greenalgae),当时的藻类及原生动物命名系统还不完善,所谓的“蓝绿藻”相当于今天的蓝藻(Cyanobacteria)。Ho和Alexander于1974年也发现Amoebaradiosa和Amoebadiscoides可以取食组囊藻(Ancystisnidulans)以及三种鱼腥藻,并发现这些变形虫体内有类似于溶菌酶的物质可以降解吞入体内的藻细胞。其他已报道的取食蓝藻的叶足纲(Lobosea)原生动物还有:Thecamoebasphaeronucleolus,Pelomyxapalustris。本实验室从滇池水样中分离到了一种纳氏虫(Naegleria),取食鱼腥藻,席藻(Phormidium),柱孢藻(Cylindrospermum),隐球藻(Aphanocapsa)等多种藻类,控藻效果显著(图1)。自然界中,有一类丝足类(Fliosea)变形虫,它们与藻类关系密切,往往和藻类共生或寄生与藻类上,以藻类为主要食物。丝足类变形虫身体呈圆球状,放射性的发出丝状伪足(Filopod),并以此移动和取食。其中报道最多的食藻种类是核虫类(Nuclearia)和吮噬类(Vampyrella)。1981年,Yamamoto从日本的Kasumingaura湖中分离到了一种核虫,这种核虫可以在铜绿微囊藻(Microystisaeruginosa)、组囊藻(Anacystisnidulans)和桶状鱼腥藻(Anabaenacylindrica)的藻苔上形成食藻斑。这种核虫通过刺透真核藻角星鼓藻(Staurastrum)和新月芽藻(Closterium)的细胞壁取食其细胞内容物,但是它取食原核藻微囊藻或者鱼腥藻时,直接吞食整个藻细胞。通过分析藻苔上形成的各种溶藻斑,Yamamoto发现原生动物形成溶藻斑的频率远远大于其他溶藻因子(细菌和真菌),并据此推断原生动物可能是湖泊水华的主要控制因素。Huang和Wu于1982年利用藻苔食斑形成法从稻田里分离到了一种肉足类变形虫和一种核虫,这两种变形虫都可以以鱼腥藻作为惟一食物,并且还可以取食念珠藻(Nostoc),颤藻(Oscillatoria)和单歧藻(Tolypothrix)等其他藻类。其中核虫可以取食各个种类的鱼腥藻,但是鱼腥藻附生子和异型胞不被取食。这两种变形虫都可以显著降低藻液中鱼腥藻细胞生物量,当食物耗尽时,它们会形成包囊。对核虫的进一步研究还有Yamamoto、Daft和Cann等人的报道。本实验室从滇池水样中分离得到了4种不同的核虫。可见核虫在滇池水环境中普遍存在,很可能对滇池水华有一定的控制作用。2.3蓝藻和红藻藻类的食性纤毛门(Ciliophora)包括三个纲:动基片纲(Kinetofragminophora)、寡膜纲(Oligohymenophora)和多膜纲(Polymenophorea),现已发现每个纲都有多种食藻纤毛虫,尤其动基片纲的食藻纤毛虫种类很多。据目前为止的报道,该纲中有18个属30多个种具有食藻能力,如:Holophrya、Merodinium(分裂虫)、Trachelius、Sonderia、Bryophrya、Colpoda(肾形虫)、Woodruffia、Furgasonia和Nassula(篮环虫)等。其中对篮环虫研究得最为深入。早在1941年,Thomas最先认识到了篮环虫在富藻类湖泊中重要的生态作用,他观察到一个瑞士湖泊中颤藻(Oscillatoriarubescencs)水华的消退是由于大量金色篮环虫(Nassulaaurea)的牧食作用(Grazing)。1959年,Poilvert对篮环虫的食性范围作了详细研究,20种实验藻种中的9种(其中包括颤藻、束丝藻、鱼腥藻和席藻)可以支持金色篮环虫的大量增殖,其他种类只能维持其有限的繁殖。1983年,Brabrand等人尝试了用篮环虫作为一种生物控藻剂,并根据篮环虫与颤藻的取食/被取食关系做了一系列的实验室和野外实验。1990年,Hildam等人对英国坎布里亚郡(Cumbria)三个湖泊中篮环虫的取食作了详细的观察。通过长时间对湖泊中藻类及原生动物种类与数量上的观察,他们发现湖泊中的主要水华藻类(水华束丝藻和颤藻)的大量繁殖和突然消退,和篮环虫数量及生活形态(营养体/包囊)密切相关。随着水华的消退,篮环虫会形成包囊并沉到湖底,当水华发生时,包囊会萌发(Excystment)成为营养体,并回到湖面上层开始繁殖和牧食。1983年Takamura和Yasuno报道在日本的Kasumigaura湖中发现一种Condylostomavorticella取食蓝藻和真核藻类。它们主要根据藻细胞的形态和大小选择取食的藻类,它们偏好球状的微囊藻(Mirocycystis)、聚球藻(Synechococcus)和束球藻(Gomphosphaeria),而不取食链状的席藻(Phormidium)和束丝藻(Aphanizomenon)。本纲主要的食藻种类是前口虫(Frontonia)、尾丝虫(Uronema)和睫杆虫(Ophryoglena)。Schaeffer发现颤藻(Oscillatoria)和鞘丝藻(Lyngbya)构成一种前口虫(Frontonialeucas)食物的重要成分。这种纤毛虫可以取食比自己身体长6到8倍的颤藻藻丝,被取食的藻丝卷曲在纤毛虫体内。一种海洋尾丝虫在海洋中分离出的集胞藻(Synechococcus)培养物(还有伴生的细菌)中生活一年以上。在尾丝虫(Uronema)对数生长期期间,它选择性的主要取食集胞藻,蓝藻数量下降了三个数量级,而细菌的数量只下降了一个数量级。3生物控藻因子分析原生动物的研究方法包括:分离、纯化、培养、鉴定,实验室中食藻特性研究,小规模野外实验(Microcosm)和大规模野外实验,最终建立与之相应的生物控藻策略。以上也是对其他生物控藻因子研究所需的流程(图2)。下面将对上述步骤作简单介绍:3.1原生动物的纯化在噬藻体、溶藻菌、真菌和原生动物等一系列控藻因子中,原生动物的体积和运动能力最强。因此用于分离食藻原生动物的水样不应经过微孔过滤(孔径1μm的滤膜可以阻止绝大部分原生动物通过),或者离心处理(3000r/min,1min的低速离心就可以沉降大部分的原生动物),水样中的杂质可以用纱布过滤除去。在分离控藻因子之前,可以利用目标藻类(如鱼腥藻)的藻液富集环境水样中的控藻因子,增大控藻因子的浓度,然后利用藻苔分离。原生动物在藻苔平板上产生的食藻斑一般比噬藻体产生的噬藻斑或溶藻菌产生的溶藻斑大,而且扩大速度最快(图1)。原生动物的纯化可以利用原生动物在藻苔平板上移动速度快的特点进行。将原生动物培养物滴在藻苔平板上,培养一段时间会出现食藻斑,待食藻斑扩大出接种区,用牙签挑取食藻斑边缘物质接种到新的藻苔平板上。这样可以去除和原生动物伴生的一些细菌和霉菌。一般来说,变形虫在藻苔平板上移动速度最快,因此这种方法最适合变形虫的分离。如果需要纯化一种移动较慢的原生动物(比如纤毛虫),其中还污染了移动较快的变形虫,只能在显微镜下挑出原生动物的营养体或者包囊,转接到新的藻板上,经过多次挑选能得到单克隆的细胞株。3.2分子进化的影响以往原生动物的微观形态结构和生活特性是其鉴定的主要标准,但是对于一种新分离得到的原生动物来说,要通过形态结构确定其所属的种类需要丰富的经验和较长的时间。生物细胞中编码rRNA的保守基因,已成为确定物种分类地位的重要标识和研究分子进化的重要参数。由于分子克隆技术的日益成熟,利用原生动物的rDNA序列鉴定其分类地位已经非常简便快捷,主要包括以下步骤:(1)总DNA的提取。操作方法和细菌总DNA提取基本一致。(2)PCR扩增编码rRNA基因中的保守区域。编码rRNA的基因中存在一些和蓝藻及细菌类似的极端保守区域,设计引物时应注意回避这些保守区域。(3)克隆测序。因为编码rRNA的基因在基因组中有多个拷贝,直接对PCR产物测序往往效果不佳。(4)序列分析。利用基因数据库(如NCBIGenBank)提供的BLAST分析,可以找到与已知rDNA相似性最高的基因序列,对应物种的系统分类可以为待定原生动物分类地位提供线索。原生动物分类地位的最终确定还需要结合形态特征,生活史等鉴定标准。3.3微镜观察食藻原生动物原生动物的分离鉴定、形态观察、食藻过程研究都需显微镜观察和分析。而利用荧光显微镜可以很方便的观察食藻原生动物的取食及消化过程。蓝藻细胞内含有大量藻胆素,在紫外光激发下可以发射出红色荧光,藻细胞被吞食进入食物泡后,仍可以发出荧光。根据食物泡的大小和荧光强弱可以研究藻细胞物质在原生动物体内的消化情况。(图3)3.4cold-chase法原生动物的食藻特性主要包括两个方面:食藻范围和食藻活性(包括以不同藻类为食物时的取食速率、消化速率以及繁殖速率)。和其他生物控藻因子不同,原生动物的食藻范围很广泛,往往只要形态条件符合的藻类就可以被它们取食,很多研究中利用惰性荧光颗粒(Inertlatexfluorescentmicrospheres)作为藻细胞的类似物,也可以被一些纤毛虫吞食。Layboun发现一种马氏虫(Mayorella),不能直接取食眉藻(Calothrix),但是,当眉藻藻丝被超声波打成小段碎片之后,就可以被马氏虫取食,并在食物泡中消化。但是某种原生动物可以取食某种藻类,并不意味着该原生动物可以作为这种藻类的控制因子,只有当藻类可以被消化,并且为原生动物的大量繁殖提供物质和能量时,这种原生动物才能显著降低目标藻类的生物量。研究原生动物取食活性的方法可以分成三大类:(1)群体操作法,如颗粒大小分级,稀释,或者估计食物类似物消失的速率;(2)使用示踪技术直接测定取食速率,如,荧光标记物;(3)从自然种群的一些特征,比如原生动物消化性酶类或者它们的食物泡内容物推断种群的取食特性。为了消除原生动物消化同时还在取食的影响,研究原生动物消化速率(Digestionrate)需要采用cold-chase的方法。在原生动物取食进入平台期(体系中原生动物数量接近饱和,并且还有足够的食物)后,将体系稀释100倍,使得体系中的藻细胞数量降到一个忽略的地步,认为原生动物此时已经无法取食,同时开始记录原生动物体内食物的消化情况。从cold-chase开始时刻以及之后4h内一些时间点取样,固定(一般采用CaCO3饱和的福尔马林溶液,终浓度2%),制片,并在荧光显微镜下利用蓝藻细胞中藻胆素的红色自发荧光估计原生动物体内未被消化的食物量。对于单细胞藻类(比如微囊藻、集胞藻)可以直接数出每个原生动物体内的藻细胞数目。而对于链状藻类(比如鱼腥藻、席藻)被取食后进入食物泡,失去细胞形态,只有结合显微镜放大倍数测量每个食物泡的直径,算出每个原生动物中食物泡的总体积(可以认为原生动物固定后,其中食物泡成球形)。为获得具有统计学意义的数据,每个时间点至少需要观察100个以上原生动物,因此,需要将观测结果拍成照片(图3),便于分析统计。用于表征消化速率的指标有细胞内容物半衰期T1/2和消化常数K,即单位时间内,被消化食物和初始时刻食物量的百分比。4控藻因子的控制在研究自然水体原生动物的食藻过程中,有很多关于原生动物大量繁殖导致水华消退的报道。但人为主动利用原生动物控制蓝藻水华夺得成功的报道不多,大都处于尝试阶段。本实验室对分离获得的各种食藻原生动物进行了一系列控藻实验,结果发现,食藻原生动物在实验室条件下对微囊藻、鱼腥藻、束丝藻控藻效果非常好,但是对天然水华(采自云南滇池)的控制作用则不明显。作者认为以下因素限制了食藻原生动物在天然水华中的控藻作用:(1)天然水体环境和实验室培养条件之间的差异。天然水体的化学成分、温度、pH值都可能影响到原生动物的食藻能力。(2)原生动物数量的限制。当原生动物的数量相对藻类生物量达到一定优势时,其控藻效果才会显现。天然水体中,原生动物增殖能力受到影响,而初次投加的原生动物会被庞大的水体稀释到远远达不到控藻的浓度。(3)天然水华的复杂性。天然水华中藻的种类很多,往往主要优势藻类(如微囊藻)数量的降低,反而引起次要藻类(如束丝藻或颤藻等)的繁盛,成为优势种,总体藻类生物量并未明显降低。(4)天然水华的顽固性。滇池野生铜绿微囊藻细胞外有一层黏液层,可以减小外界环境对微囊藻细胞的影响,会对食藻原生动物的取食产生极大