中国对虾人工授精方法的建立

中国对虾人工授精方法的建立

在对日本虾加工方法的研究中，许多研究是精细移植和对室外虾加工的研究。Persyn最早研究成功对虾精荚移植方法,他用手挤压雄性对虾第5对步足基部的精荚囊,将挤出的精荚粘贴在雄性对虾腹部,该方法应用于具开放式纳精囊的对虾类。Sandifer等采用相同的方法对罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)进行了人工授精,并在1980年研究使用电刺激法获取精荚并获得成功。此后Muthu等和Lin等将人工精荚移植技术应用到斑节对虾(Penaeusmonodon)也获得了成功。杨丛海等应用改进的电刺激装置采集中国对虾雄虾的精荚,并进行了人工授精实验。在体外人工授精方面,Clark等以褐对虾(Penaeusaztecus)为实验材料,将解剖的卵子和精子混合,首次获得了虾类体外人工授精的成功,但受精率仅10%,且重复性较差。Lin等研究过斑节对虾的人工体外授精,选用未交尾的雌虾,在雌虾产卵前后的不同时刻,将精液加到不同容积的产卵池中,分别获得了63.11%,52.29%和49.44%的孵化率。孔杰等和包振民等也就中国对虾的体外人工授精技术方法进行过研究。虽然精荚移植技术已经成功用于中国对虾的人工繁殖,但在建立家系进行中国对虾选择育种方面,精荚移植法建立半同胞家系的数量和成功率都有一定限度,不能很好满足中国对虾选择育种所需建立的全同胞和半同胞家系数量,家系数量不足会影响到遗传参数估算的准确性,以及对每个世代留种个体的育种值和选择指数造成偏差。而体外人工授精需要杀死雌虾或静候母体产卵,十分费时费力,在生产实践中应用受到限制。因此,需要改进或尝试建立新的人工授精技术来建立足够的全同胞和半同胞家系,以保证各种参数的准确性和育种工作的顺利进行。本实验应用完整精荚移植和输精管移植,并尝试精荚切块移植和精液移植进行中国对虾的人工授精,对比了4种方法的授精成功率、受精率和幼体的孵化率,最终获得了101个全同胞家系,和29个半同胞家系,为以后的选择育种工作打下了坚实基础。1材料和方法1.1越冬亲虾的选择实验在黄海水产研究所鳌山卫实验基地进行,材料采用未交尾的越冬亲虾:乳山湾海捕中国对虾、青岛近海海捕中国对虾和朝鲜群体养殖二代中国对虾,以及黄海所鳌山卫实验基地的养殖亲虾。1.2精荚移植的方法2005年3月24-25日,采用4种人工授精方法,对未交尾雌虾进行人工授精。完整精荚移植法:取雄虾、雌虾各1尾,用酒精棉球擦拭体表。用手挤压雄虾第五对步足基部的精荚壶腹部,挤出精荚,小心地剥去精荚囊,剪去瓣状体,用镊子夹住瓣状体基部,将整个精荚放入撑开的未交尾雌虾纳精囊中。输精管移植法:将输精管中端部分取出,所取输精管长短要根据雌虾纳精囊的大小进行调整,一般0.5~1.5cm左右,移植到雌虾纳精囊中。精荚切块移植法:将精荚切块,一个精荚可以切成2~3块,然后分别移植到几尾雌虾的纳精囊中。精液移植法:取已交尾的雌虾,用酒精棉球擦拭体表,特别是纳精囊部位,然后用手挤压纳精囊,使精子团露出,用消毒过的注射针头蘸取适量精液,根据精液量的多少分成多份,分别移植到未交尾雌虾纳精囊中。一般1尾雌虾纳精囊中的精液可以移植到2~4尾雌虾中。1.3亲虾的授精成功率将人工授精后的亲虾每尾单独置于室内2.8m3(2m×1m×1.4m)的方缸中,将水温控制在14℃,促其产卵。实验用水为沙滤水,盐度25~29,pH8.2~8.6。亲虾产卵后,根据是否出现受精卵,采用授精成功率指标来衡量4种移植方法各自的授精成功情况。授精成功率为该移植方法中出现受精卵的亲虾数与采用该方法总共移植的亲虾数的比值。每天观察产卵情况,在亲虾产卵后,随机收集200粒卵在显微镜下观察,统计受精率。受精率为受精卵数与所收集卵子的总数之比,以出现受精膜和能进行正常细胞分裂为指标。产卵后将亲虾捞出,将水温缓慢升至16~18℃,进行幼体孵化,并计算变成无节幼体时的孵化率。孵化率为无节幼体数量与受精卵数量的比值。1.4处理数据应用SPSS分析软件对4种方法获得的平均受精率和平均孵化率进行单因素方差分析(ANOVA),比较其差异显著性。2结果与分析2.14不同人工体外授精方法获得的成功率比较4种人工授精方法移植的亲虾数、授精成功的亲虾数及授精成功率见表1。从表1可以看出,4种人工体外授精方法均获得了较高的授精成功率,都在50%以上。其中,完整精荚移植的授精成功率最高,为80.8%,输精管移植的授精成功率最低,为53.3%。2.24采用人工精测法的显著性统计对出现受精的卵进行受精率统计,每种方法的平均受精率见表1。从表1可以看出,4种人工体外授精方法均获得了较高的平均受精率。2.34幼被孵化的培养情况对受精卵变成无节幼体的孵化率进行统计。结果显示,4种人工授精方法获得的幼体平均孵化率均很高,都在80%以上,具体见表1。无节幼体经选优后,取2万尾进行培育,发育到仔虾阶段时统计家系数量,总共获得的全同胞家系数量为101个,半同胞家系的数量为29个,每个家系虾的平均数量在5000尾左右。2.4总体受精率的测定4种人工授精方法获得的平均受精率和平均孵化率经SPSS统计软件分析,结果显示:4种人工授精方法获得的平均受精率之间和平均孵化率之间均差异不显著(P>0.05)。3讨论3.1营造良好的模范作用,进行精密度调整影响人工授精效果好坏的因素很多,为了获得好的授精成功率和受精率,首先在挑选亲虾时,要选择发育良好、身体健康的雌虾和雄虾。另外,对虾精子也像许多水生生物的精子一样,在没有卵子存在的情况下,入海水后发生顶体反应,并因此而失去受精能力。发生顶体反应的精子越多,受精能力越弱,因此在移植过程中,特别是进行精荚切块移植、输精管移植和精液移植时,不要让移植部分接触海水。再次,在人工授精操作过程中,要确保操作的准确性和整个过程的消毒工作。在操作过程中,尽量不要让雌虾受伤,特别是雌虾的纳精囊底部,由于该部位血管丰富,如果不小心碰破,会引起血管破裂,血液溢满纳精囊,影响受精,从而导致移植失败。对于输精管移植,精子质量好坏会直接影响到受精效果,而输精管不同部位的精子成熟度是不同的,吴长功等的研究表明,中国对虾的输精管可分为近端、中间、远端输精管及壶腹4部分,精子在精巢内产生,并在输精管内进一步发育为精子,成熟的精子被输送到壶腹内,聚集成团,外包胶体物质,形成精荚。陈俅等研究表明,精子进入输精管中段时与该处分泌物相混合形成精子团,并在该处停留较长时间,故中段输精管兼有输精和贮精的功能。本实验用越冬雄虾的输精管进行人工受精,获取部位是输精管中端部分,移植时间是3月底和4月初,获得了66.8%的平均受精率,其中最高受精率为94.8%,并进一步验证了王清印等得出的越冬雄虾输精管中的精子已达成熟程度,并具有受精能力的结论。本实验首次采用精液移植法进行中国对虾的繁殖并获得成功,其平均受精率为46.8%,最高受精率为78%。对于获得的平均受精率不高,我们分析原因可能是移入的精子团体积小,使雌虾纳精囊没有形成有效的刺激而使纳精囊闭合不紧,造成少量海水渗进而使部分精子失活,但在雄虾不足时,此方法仍可以用于中国对虾的家系建立。3.2不同社会公众对体外人工授精的要求杨丛海等应用改进的电刺激装置采集中国对虾雄虾的精荚,使用未交配雌虾进行人工授精,每尾雌虾的纳精囊中移植1个精荚,成功率为35%~75%,其中1尾雌虾产卵后受精率最高达93.6%,该虾后来再次产卵,受精率仍达94%。在本实验中,4种授精方法的授精成功率为50%~80.8%,获得的最高受精率分别为97.5%、94.8%、98.2%、和78%,可见,这4种授精方法也可以取得理想的授精效果。在中国对虾体外人工授精研究方面,孔杰等采用干法授精、湿法授精、半湿法授精和滴管法授精,获得平均的受精率依次为27.73%、40.02%、27.53%和61.62%。本实验采用完整精荚移植和输精管移植获得的平均受精率分别为66.2%,66.8%,最新尝试的精荚切块移植和精液移植,其平均受精率分别为65.4%、46.8%,获得的幼体平均孵化率均在80%以上。由于体外人工授精需要杀死雌虾或静候母体产卵,十分费时费力,故在生产实践中应用受到限制,而人工移植授精法,只要有性成熟个体,于母体产卵前随时都可进行人工移植,勿需为了掌握受精时机而长时间等候母体产卵,故在生产上具有较强实用性。由此可见,在中国对虾选择育种过程中,可以采用以完整精荚移植和精荚切块移植的方法,在雄虾不足时可以结合输精管移植和精液移植为补充的方法来建立大量的同胞和半同胞家系。3.34种人工授精方法在精荚切虾的移植外增加了建立半保在建立半同胞家系方面,1尾雄虾有两个精荚,若采用完整精荚移植法,1尾雄虾最多可与两尾雌虾进行移植,若两尾雌虾均能产生后代,则建立半同胞家系的数量为1个,若其中1尾不能产生后代或两尾都没有后代,则不能建立半同胞家系。而对于精荚切块移植和精液移植,由于可以与多尾(2~4尾)雌虾进行移植,故提高了让更多雌虾产生后代的可能性,所以增加了建立半同胞家系的机会。另外,