实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time-PCR )

实时荧光定量PCR(QuantitativeReal-time-PCR)什么是qPCR、Real-time-PCR？Real-time-PCR和qPCR（QuantitativeReal-time-PCR）都是实时定量PCR，指的是PCR过程中每个循环都有数据的实时记录，因此可以对起始模板数量进行精确的分析。

虽然Real-timePCR（实时荧光定量PCR）和ReversetranscriptionPCR（反转录PCR）看起来都可以缩写为RT-PCR，但是，国际上的约定俗成的是：RT-PCR特指反转录PCR，而Real-timePCR一般缩写为qPCR（quantitativereal-timePCR）。Real-time-PCR的前驱步骤细胞/组织RNA的提取。逆转录PCR或者称反转录PCR(reversetranscription-PCR,RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。Real-time-PCR的原理荧光染料：荧光染料也称DNA结合染料，目前主要使用的染料分子是SYBRGreenI，SYBRGreenI能与DNA双链的小沟特异性的结合，游离的SYBRGreenI几乎没有荧光信号，但结合双链DNA后，其荧光信号可呈数百倍的增加。随PCR产物的增加，PCR产物与染料的结合量也增大，其荧光信号强度代表双链DNA分子的数量。SYBRGreenI方法是一种最基础也最常用的Real-timeqPCR实验手段。PCR产物的扩增扩增循环结束后，降温至60℃，然后加热升温至95℃变性DNA产物。变性

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高温孵育将dsDNA变成成单链，并松弛ssDNA中的二级结构。退火

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退火期间，互补序列结合。延伸

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70-72℃，DNA聚合酶活性最佳，并且以每秒100个碱基的速率延伸。当qPCR中的产物长度较小时，此步骤可与退火在60℃同步进行。不同公司的SYBRGreen需要的上机条件略有不同，具体参考书明书。Real-time-PCR的原理在Real-timeqPCR中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的检测并记录其荧光信号，随着反应的进行，监测到的荧光信号可以绘制成一条曲线，即为扩增曲线。荧光扩增曲线一般分为基线期、指数增长期和平台期。扩增早期，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化，此时即为基线期。在荧光信号的指数增长期，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，一般选择在这个阶段进行定量分析。基线期平台期扩增期检测指标：CT值阈值循环数（Cyclethreshold，Ct值）的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。Ct值与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始模板浓度越高，Ct值越小；起始模板量浓度越低，Ct值越大。这就是荧光定量PCR的理论基础。数据分析相对定量，不像绝对量化严格，应用于大多数基因表达水研究。相对定量关注的并非某个基因的绝对表达量，而是同一基因在样本间的表达差异(如实验组和对照组)。结果以处理组相对于未处理组的表达差异倍数表示。这种分析方法不需要测定精确的拷贝数，重点是在与未处理样品组相比的表达变化上。相对定量算法—ΔΔCt,ΔΔCt方法是比较组别间同一基因表达差异的常用方法。通过将目的基因Ct(Ct目的)与自身内参Ct值（Ct内参）进行比较，可得到每一组别的ΔCt，再将实验组与对照组进行计算得到ΔΔCt。ΔΔCt的大小关联目的基因表达水平的倍数差异大小。倍数差异=2^-ΔΔCtΔCt实验组–ΔCt对照组=ΔΔCtCt目的实–Ct内参实=ΔCt实验组Ct目的对–Ct内参对照=ΔCt对照组常见问题与解决方案扩增曲线形状异常扩增曲线不光滑:信号太弱，经系统矫正后产生。提高模板浓度重复实验。扩增曲线断裂或下滑:模板浓度较高，基线的终点值大于C值。减小基线终点(CT值-

4)，重新分析数据。个别扩增曲线突然骤降:反应管内留有气泡。处理样本时要注意离心，进行扩增反应之前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。反应结束无扩增曲线出现反应循环数不够:一般设置循环数为40，但需要注意的是过多的循环会增加过多的背景信号，降低数据可信度。确认程序中是否设置了信号采集步骤:两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段;三步法扩增程序应当将信号采集设置在72C延伸阶段。确认引物是否降解:长时间未用的引物应先通过电泳检测完整性，以排除其降解的可能。模板浓度太低:减少税释度重复实验，一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。模板降解:重新制备模板，重复实验。CT值出现太晚扩增效率极低:优化反应条件，尝试三步法扩增程序，或者重新设计合成引物。模板浓度太低:减少税释度重复实验，一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。模板降解:重新制备模板，重复实验。PCR产物太长:推荐PCR产物长度为80-150bp。体系中存在PCR抑制剂:一般为模板带入，加大模板梯释倍数或者重新制备模板重复实验。阴性对照出现明显扩增反应体系污染:更换新的湿合料、ddH0、引物重复实验。反虚体系在超净工作台内配制，减少气溶胶污染。引物二聚体的出现:配合熔解曲线进行分析。绝对定量时标准曲线线性关系不佳加样误差:提高模板稀释倍数，提高加样体职。标准品降解:重新制备标准品，重复实验。模板浓度太高:提高模板释倍数。熔解曲线出现多峰引物设计不优:根据设计原则设计合成新的引物。引物浓度太高:适当降低引物浓度。cD