细胞毒性T淋巴细胞生物杀伤效应的检测方法

细胞毒性T淋巴细胞生物杀伤效应的检测办法作者：王政,田菲菲,刘丁,吕凤林【核心词】T淋巴细胞生物杀伤细胞毒性细胞介导的免疫效应在机体抗感染免疫、抗肿瘤免疫、移植排斥效应和本身免疫性疾病发生机制中发挥重要作用,重要效应细胞之一为细胞毒性T淋巴细胞(CytotoxicTlymphoclyte,CTL)。近年来,基于CTL特异性表位的多肽疫苗已经成为研究热点之一,CTL的活化及对靶细胞的杀伤效应成为衡量疫苗质量的重要因素之一。现在已经报道许多新的评价CTL活性及其杀伤效应的办法,现就此做一综述。1单个细胞水平测定CTL活性现在普通惯用的有产生细胞因子的细胞记数法和有限稀释分析法(LDA)。活化的T淋巴细胞可分泌某些功效性的细胞因子,如IL2、IFNγ、TNFα等,由于分泌不同种类细胞因子能够分辨不同免疫功效的记忆细胞或效应细胞,这样能够在体外评价外周血单个核细胞（PBMC）中抗原特异性T细胞的数量和功效状态。现在惯用的检测细胞因子的办法如ELISA、ELISPOT、PCR/RTPCR及细胞内因子检测等。1.1有限稀释分析法(Limitingdilutionanalysis,LDA)该办法是迄今应用较广泛的定量分析系统［1］。LDA法使我们能够具体理解免疫反映动力学和记忆CTL(MemoryCTL,mCTL)细胞亚群的细胞周期［2］,也是对pCTL和mCTL亚群细胞表面的激活标志物进行研究的良好办法。但此办法也存在缺点,重要是:(1)在LDA条件下,进一步刺激会使效应CTL(eCTL)细胞加紧凋亡［3］,使CTL活性测定值变动较大,对eCTL细胞数量不能测定或测定值偏低。(2)实验较繁琐,由于在实验之前,首先需要将淋巴细胞表面体现的CD分子,如CD44或CD62L进行染色,再用FACS法分类筛选,然后在LDA条件下培养6d;这样就会造成T细胞数量损失,特别是在活化状态进行筛选和分离时。1.2ELISAELISA可直接检测肿瘤患者体液如血液中的细胞因子(如IL2、IFNγ或TNFα)水平,也可用于测定激活的淋巴细胞(诸如LAK或CIK细胞)培养液中各细胞因子水平,这是评定免疫活性细胞激活程度和免疫状态的重要指标。固然,ELISA法检测的是一群细胞产生的细胞因子总量,无法给出单一细胞的信息和精确估算抗原特异性T细胞数量,并且,它不能检测淋巴细胞被抗原刺激后产生细胞因子的能力。在肿瘤免疫检测中,随着ELISPOT技术的发展,ELISA法的应用已逐步减少。1.3固相酶联斑点法(Enzymelinkedimmunospot,ELISPOT)基于酶联免疫标记技术的基本原理建立的ELISPOT技术不仅敏捷度大为提高,并且能得到分泌细胞因子的细胞频数。CTL受抗原刺激后一旦分泌功效性细胞因子,就被预包被的抗体直接捕获,通过局部形成的斑点数目得出分泌细胞因子的T细胞频数,从而反映抗原特异性CTL的活性。此法的优点在于:(1)激活的T细胞周边环境中细胞因子高度浓集,即使只分泌100个因子的细胞,也能被检测出来,敏感性很高;(2)使用的2种单克隆抗体普通识别同一种因子的2个不同表位,特异性很高;(3)可对T细胞直接进行检测,不需要体外扩增,所需的T细胞量较少,应用冻存的PBMC能够重复检测多个细胞因子;(4)在检测细胞数量的同时也可反映其功效,与临床成果有关性较好。但是ELISPOT法也有某些缺点:检测到的T细胞必须能分泌目的细胞因子,如果T细胞无功效或分泌其它的细胞因子,就有可能低估抗原特异性细胞的数量;除了CTL,某些辅助T淋巴细胞(CD3+和CD4+)、自然杀伤细胞等也可分泌相似的细胞因子,故还需结合细胞表型的分析,为解决这一问题,现在已有同时检测两种细胞因子的办法［4］。Malyguine等［5］比较了分别对GrB(颗粒酶B)ELISPOT法、IFNγELISPOT法和51Cr释放法进行了比较,实验成果显示三者的有关性较好,并指出检测GrBELISPOT法与51Cr释放法的反映性非常靠近,而比IFNγELISPOT法和四聚体法更快速更直接。ELISPOT法所需细胞少,鉴定抗原表位效率很高。另外基于IFNγ或TNFγ分泌性CD8+T细胞的ELISPOT法已用于检测几个MHCⅠ类分子限制性黑色素瘤抗原,如MAGE、gp100、Mart1、酪氨酸酶等［6］。缺点是大数量的斑点,或者斑点的形状变异较大而造成人工分析变得很困难。如果应用计算机辅助成像检测技术即可解决此问题,还能够拟定分析斑点的面积,分析T淋巴细胞对特异性抗原的反映能力。1.4染色细胞内的细胞因子体外培养、刺激、活化细胞,用BrefeldinA封闭细胞因子分泌途径,使细胞因子在细胞内累积。然后,用荧光或生物素标记的CD4+或CD8+的mAb对细胞进行CD4或CD8表面标志物染色,再经去污剂固定并增高细胞通透性,使抗细胞因子荧光抗体结合到细胞内［7］。近来已经建立了CD4+T细胞和CD8+T细胞的抗原特异性细胞因子分泌细胞的细胞内染色办法。此办法应用细胞内累积细胞因子的染色和多个颜色参数的FACS法,是检测人循环淋巴细胞中抗原特异性T淋巴细胞的可行办法。1.5基因水平的检测通过PCR、RTPCR或荧光定量PCR能够对细胞因子的DNA或RNA进行检测,这是检测一种或多个目的基因转录水平的较为精确的分子生物学办法。Kruse等［8］曾用荧光定量RTPCR法分析了冷冻保存的正常人血标本中的细胞因子mRNA水平,许多肿瘤免疫的临床实验中,也都应用了该法作为检测免疫反映的指标。定量RTPCR可拟定抗原特异性T细胞的数目,并且不需要任何体外刺激环节,是现在最敏感的细胞因子检测技术。2MHC肽四聚体法(solubleMHCpeptidetetramer)人们对MHCⅠ类分子与小分子多肽的共价结合复合物(MHCⅠpep)的制备及其与TcRαβ的识别与结合的研究已经获得了长足的进步,从而出现了一种崭新的技术:MHCⅠ类分子抗原肽(MHCⅠpep)四聚体法。以往认为,如果缺少抗原持续刺激,CD8+T细胞的记忆寿命将较为短暂,而四聚体法研究成果却发现并非如此,在无抗原刺激的状况下,有一定数量的mCTL可长久存在。但同时也揭示了CD8+T细胞记忆的固有限制性,认为淋巴组织中的抗原特异性CD8+T细胞对特异抗原的刺激再反映需要时间,然后还要将它们从淋巴组织向非淋巴组织集中。该法克服了51Cr释放法,LDA等办法的局限性,能够应用于多个抗原特异性CTLs的表型分析和分离［9］,也能够用来检测抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞反映。它的重要优点是:检测得到的T细胞数量比常规办法要高10倍［10］,这是由于MHC肽四聚体的结合仅仅需要适宜的TCR体现,能够检测到全部的特异性T细胞,不管是祖细胞还是效应细胞,也不管有无功效;另首先,MHC肽四聚体标记的T细胞能够通过表面标记分析或功效分析(如胞内细胞因子检测)进一步定性,也能够通过流式细胞术或MHC多肽多聚体包被的珠粒对特异性T细胞进行收集、纯化和克隆［11］,避免了体外刺激的多个循环环节。但是,该法也存在某些限制:(1)感爱好的肽段必须装配于四聚体中,因此肽段必须是已合成的,因此只限于检测已经拟定的T细胞表位;(2)由于MHC多肽四聚体定量T细胞的敏感性极高,无法拟定标记的T细胞与否有功效;(3)可靠性受到标本制备的限制,有时T细胞克隆不被染色［12］,且T细胞活化所需的TCR亲和力和四聚体染色所需的亲和力之间的关系现在还不很清晰;(4)尽管Ⅱ型MHC肽四聚体曾被描述过,传统上只有Ⅰ型MHC肽四聚体能够广泛应用。迄今为止,MHCⅠpep四聚体法已被用于研究病毒性感染及肿瘤等疾病,如HIV、EBV、HTLV、HCMV及白血病等的研究。此办法的出现能够说是对细胞免疫研究的里程碑,存在的问题重要是:每个四聚体均需针对特定的MHCⅠ类分子而设计,并且以免疫球蛋白为连接物的办法亦有极大应用潜力,但现在研究中应用并不广泛。现在,在美国NIH已有专门的研究开发小组对此办法的各方面进行进一步发展,以期办法和试剂能够合用于该领域的多个状况。3CTL杀伤效应的检测3.151Cr释放法20世纪60年代末建立的51Cr释放法是测定CTL功效最典型办法。该法成果精确、重复性好,但存在下列局限性:(1)51Cr有放射性,不利于安全操作及废物处置,并且自发释放率高,半衰期短(27.8d),无法用于需多次测定的动物实验;(2)不是定量分析,操作环节多而细胞共育时间短,不能在单细胞水平进行测定,但有研究者同时运用ELISPOT法和51Cr释放法进行检测［13］;(3)从效应细胞角度而言,由于从外周血中直接得到的效应细胞极少,需进行多次体外刺激,可能会造成T细胞的构成及活性与体内状态不同［14］;从靶细胞方面考虑,由于自体肿瘤很难得到,不得不经常使用某些替代靶细胞,如HLA配型相似的异源肿瘤细胞系或可负载目的抗原的细胞,实验成果可能不会反映体内CTL细胞的真实活性［15］;(4)与临床成果有关性存在某些问题,有研究表明,CTL活性低的患者在临床上反而出现了肿瘤缩小。另外,建立该办法时还没有CTL表位被鉴定,对细胞的体外刺激采用全抗原,不存在表位肽体外刺激的问题。随着抗原表位的大量鉴定,现在普通规定鉴定抗原表位特异性CTL应答,实验中经常碰到的问题是表位肽特异的CTL杀伤活性的检测普通不太敏感,郭波等的研究［16］表明:存在的游离多肽可明显减少表位特异性的CTL对靶细胞的杀伤效应,影响杀伤的敏感性,另外通过FicollHypaque离心,将死细胞从活细胞中去除,或加入IL2能够提高杀伤的敏感性。3.2LDH释放法细胞胞质中富含乳酸脱氢酶,正常状况下不能通过细胞膜,当细胞受损或死亡时可释放到细胞外,因此细胞死亡数目与细胞培养上清中LDH活性成正比,用比色法测定实验孔LDH活性,并与靶细胞对照孔进行比较,可计算效应细胞对靶细胞的杀伤百分率［17］。LDH释放法的优点在于自然释放率低,无需预标靶细胞,避免同位素掺入法的不稳定性和放射性污染,并且排除了形态观察法的主观差别性,含有大量样本快速检测的优点。但是LDH是细胞本身生长代谢的产物,可能存在自发释放现象,并且效应细胞作用于靶细胞后也会有不同程度的损伤,同样会释放LDH,这些都会影响细胞毒活性检测的精确性,另外较高浓度的胎牛血清中所含的LDH可能会干扰成果。3.3报告基因转染法应用基因转染技术将原核或真核生物的报告酶如β半乳糖普酶(βgalactosidase,βgal)或荧光素酶(luciferase,luc)基因转染靶细胞,建立稳定转染靶细胞系,以此测定CTL介导的细胞毒和细胞凋亡。通过测定释放入培养液中报告酶活性(代表靶细胞死亡数目),能够计算效应细胞杀伤靶细胞百分率。其中βgal半衰期较luc长,应用较为方便。本法优点在于:（1）敏捷度高,自发释放背景低;（2）用不同报告基因转染的细胞系可同时测定杀伤效应,成果互不干扰,还可通过转基因小鼠进行在体CTL活性研究;（3）用不同的基因调控元件(如组织特异性的或活性可诱导的启动子)控制报告基因的体现,可进一步进一步进行机制研究。其重要局限性是建立报告基因稳定转染细胞系费时费力;报告基因在有些靶细胞难以转染或体现。3.4荧光测定法荧光测定法测定CTL活性是近年来发展的。它涉及alamarBlue一步荧光测定法、alceinAM荧光扫描测定法、PEmAb/FITCannexinV荧光标记法、DIOC18(3)/碘化丙锭（PI）荧光标记法和PKH26/CFSE荧光标记法等。这些测定所基于的原理都与51Cr释放实验基本相似:将标记物质渗入到靶细胞内,CTL杀伤靶细胞后,检测这些物质释放到培养基内的水平。不同的是alamarBlue为活细胞代谢批示剂,易溶于水,进入细胞后经线粒体酶促还原产生荧光及颜色变化,可用以定量;Calceinacetoxymethy1酯（CalceinAM）是一种胞浆荧光标记物,本身无荧光,渗入细胞后细胞内酯酶催化生成的水溶性绿色荧光物质不易透出细胞。荧光测定法仍面临两个问题:（1）即使随着荧光测定仪器的普及和新的荧光标记物的发现,荧光测定法将有可能取代传统的51Cr释放法,但由于荧光测定法基于的原理近似于51Cr释放法,因此都不能从本质上解决不同靶细胞标记效率不同、CTL杀伤活性的检测不够敏感等问题;（2）其它的非基于51Cr释放法的检测,则由于只能反映CTL与否活化,而不能反映这些活化的CTL与否有杀伤功效。事实上,有证据已经提示,在某些慢性感染和恶性肿瘤中,即使有CTL的活化,但没有杀伤活性［16］。总之,以上介绍的有关CTL生物杀伤效应的测定办法各有特点,现在应用较多的肿瘤免疫CTL检测办法中,51Cr释放法被认为是评价抗原特异性CTL反映的金原则,但该法无法检测不具增殖潜能的T细胞前体;ELISPOT能更精确地反映T细胞在体内的状况,但仍依赖一定时间的肽诱导以产生细胞因子,会低估总的特异性CTL数量,但是敏感度远高于51Cr释放法;MHC肽复合物多聚体染色法,是现在最新的直接检测特异性CTLs的办法,能够直接对T细胞染色,还可结合流式细胞术（FCM）计数细胞,敏感性大大增强,又不受基因型的限制。有某些实验对肿瘤免疫检测的多个办法成果有关性进行了比较,Tan等［18］在研究EBV有关抗原特异性CD8+细胞数目时,发现MHC肽四聚体染色的成果是ELISPOT的414倍,是51Cr释放法的513倍;Whiteside等［19］在对8名转移性黑色素瘤患者进行免疫治疗时发现,四聚体染色检测所得的特异性CD8+细胞数目最多,FCM次之,最少的是ELISPOT,并且三种办法之间无明显有关性。产生这种成果的因素可能是,四聚体与T细胞结合只需要T细胞体现TCR即可,而ELISPOT则规定T细胞有功效。总之,免疫学检测成果与临床疗效之间的关系比较复杂,到现在为止还没有完全摸清两者之间的有关性。【参考文献】［1］MarijtE,WafelmanA,vanderHoornM,etal.PhaseI/IIfeasibilitystudyevaluatingthegenerationofleukemiareactivecytotoxicTlymphocytelinesfortreatmentofpatientswithrelapsedleukemiaafterallogeneicstemcelltransplantation［J］.Haematologica,,92(1):72-80.［2］LauLL,JamiesonBD,SomasundaramT,etal.CytotoxicTcellmemorywithoutantigen［J］.Nature,1994,369(6482):648-652.［3］GreenDR,ScottDW.Activationinducedapoptosisinlymphocytes［J］.CurrOpinImmunol,1994,6(3):476-487.［4］OkamotoY,AbeT,NiwaT,etal.DevelopmentofadualcolorenzymelinkedimmunospotassayforsimultaneousdetectionofmurineThelpertype1andThelpertype2cells［J］.Immunopharmacology,1998,39(2):107-116.［5］MalyguineA,StroblS,ZaritskayaL,etal.NewapproachesformonitoringCTLactivityinclinicaltrials［J］.AdvExpMedBiol,,601:273-284.［6］HerrW.Detectionandquantificationofblood2derivedCD8+TlymphocytessecretingtumornecrosisfactoralphainresponsetoHLAA21bindingmelanomaandviralpeptideantigens［J］.JImmunolMethods,1996,191(2):131-142.［7］JungT.Detectionofintracellularcytokinesbyflowcytometry［J］.JImmunolMethods,1993,159(122):197-207.［8］KruseN,PetteM,ToykaK,etal.QuantificationofcytokinemRNAexpressionbyRTPCRinsamplesofpreviouslyfrozenblood［J］.JImmunolMethods,1997,210(2):195-203.［9］MaciejewskiJP,O’KeefeC,GondekL,etal.Immunemediatedbonemarrowfailuresyndromesofprogenitorandstemcells:molecularanalysisofcytotoxicTcellclones［J］.FoliaHistochemCytobiol,,45(1):5-14.［10］MuraliKrishnaK,AltmanJD,SureshM,etal.CountingantigenspecificCD8Tcells:areevaluationofbystanderactivationduringviralinfection［J］.Immunity,1998,8(2):177-187.［11］BodinierM,PeyratMA,TournayC,etal.EfficientdetectionandimmunomagneticsortingofspecificTcellsusingmultimersofMHCclassⅠandpeptidewithreducedCD8binding［J］.NatMed,,6(6):707-710.［12］ThurnerB,HaendleI,RoderC,etal.Vaccinationwithmage3A1peptidepulsedmature,monocytederiveddendriticcellsexpandsspecificcytotoxicTcellsandinducesregressionofsomemetastasesinadvancedstageⅣmelanoma［J］.JExpMed,1999,190(11):1669-1678.［13］GallagherRC,WaterfallM,SamuelK,etal.BlooddonorderiveddendriticcellsandcytotoxicTcellsforspecificfusiongeneadoptiveimmunotherapy［J］.VoxSang,,92(4):351-360.［14］KhleifSN,Abra