欧李愈伤组织诱导及培养研究

欧李愈伤组织诱导及培养研究

近年来，植物组织培养的安全性取得了很大进展，大多数重要的果树种类都涉及到了果树上。有近300种果树类植物器官外植体经过脱分化后,再分化成不定芽,不少果树种类再生植株获得成功。优系欧李[Cerasushumilis(Bge.)Sok]是李属的新果树,具有优良的生物学特性,果实艳丽,风味独特,营养丰富,且花期观赏价值极高,集多种用途于一身。为了尽快扩大优系欧李的种植规模,将其推向市场,作者以优系欧李的茎、叶为外植体,进行了愈伤组织的诱导与培养以及植株再生的研究,试图在短期内获取大量的优质种苗,现已取得较好的结果。1材料和方法1.1外植体的预处理采用2年生欧李实生苗,于早春将植株移入花盆培养,从萌发的嫩枝上剪取茎段和叶片做外植体,以自来水流冲洗20~30min,再以吐温-20(Twain-20)溶液洗涤,自来水冲洗直至洗掉全部泡沫,后用70%酒精浸泡30~50s,无菌水冲洗4~6次,备用。1.2愈伤组织的诱导分化诱导愈伤组织发生的基本培养基为改良MS和WPM2种。每种基本培养基分别附加不同质量浓度的2,4-D,NAA,IBA,BA,添加卡拉胶0.65%,蔗糖3%,pH5.8。将消毒的嫩茎切成0.3~0.5cm的茎段,叶片切成0.3~0.5cm2大小,通过无菌操作接种到培养基上,培养温度25~28℃,光照度1500~2000lx,光照时长12~14h/d。愈伤组织诱导分化的基本培养基分别设为1/2MS、1/3MS、1/4MS和WPM4种。在每种培养基中附加BA的质量浓度为1,2,3mg/L,共12种培养基组合,卡拉胶和蔗糖质量浓度同诱导愈伤组织培养基。从愈伤组织培养中选择生长正常、分化良好的愈伤组织切块转接到分化培养基上,培养条件同前,每3~5d观察1次。2结果与分析2.1受伤后组织的诱导和培养2.1.1诱导愈伤组织的测定结果见表1,2。从表1,2可以看出,以改良MS为基本培养基,附加生长素2,4-D或NAA或IBA诱导愈伤组织的脱分化培养中,试验所设计的培养基均能诱导出愈伤组织,但愈伤组织发生的时间、愈伤组织质量、愈伤组织的大小和存活期等均不相同。在以叶片为外植体的处理中,培养基附加NAA或2,4-D的质量浓度低于0.2mg/L,经10d培养均未产生愈伤组织;只有当质量浓度高于0.2mg/L时,才能诱导愈伤组织。以茎段为外植体的处理也出现类似现象。随着生长素质量浓度的增加,茎或叶愈伤组织的发生量增大,愈伤组织生长速度加快,但愈伤组织颜色变褐,当2,4-D质量浓度达到4.0mg/L时愈伤组织发生受到抑制,质量极差,存活期短。试验结果表明,改良MS培养基附加NAA质量浓度0.40~1.00mg/L和IBA0.20~0.50mg/L的处理诱导叶愈伤组织的效果较好,附加2,4-D诱导茎愈伤组织较为适宜的质量浓度范围为0.15~0.50mg/L,NAA为0.04~0.30mg/L。2.1.2激素质量浓度对叶愈伤组织质量的影响对改良MS培养基中分别附加不同质量浓度的NAA(或2,4-D)+BA的组合试验观察发现,不同激素质量浓度处理的培养基均能产生愈伤组织,而且产生愈伤组织的速度和质量均较只用生长素效果好,可能得到良好的愈伤组织(多为浅绿色,较致密,呈粒状,愈伤块大,存活期一般在20d以上)(见表3)。从表3看出,改良MS培养基附加激素质量浓度低于2,4-D0.40mg/L+BA0.08mg/L有利于茎段愈伤组织的分化,而且愈伤组织形成时间短,愈伤组织质量好。其中改良MS培养基附加2,4-D0.20mg/L+BA0.04mg/L是适宜的茎段愈伤组织分化培养基。但对于叶片来说,尽管有的培养基上愈伤组织发生多,愈伤组织形成时间短,但愈伤组织质量差。总的看来,叶片愈伤组织形成的时间要比茎段时间长。一般随激素质量浓度的增大,叶愈伤组织形成的时间缩短,质量好。当2,4-D质量浓度增加到4.00mg/L、BA质量浓度增至0.40mg/L时,叶片愈伤组织形成受到抑制。茎段在供试激素质量浓度的范围内,一般愈伤组织形成的速度相近,当2,4-D质量浓度增至4.00mg/L、BA质量浓度为0.40mg/L时也抑制其发生,茎段愈伤组织发生量随激素质量浓度增大而减少,愈伤组织质量差。随着NAA+BA的质量浓度增大,叶愈伤组织数量增多,愈伤组织质量提高,愈伤组织形成时间短。当激素质量浓度增大到NAA1.00mg/L+BA0.2mg/L时,无论是愈伤组织质量和数量还是愈伤组织形成的速度、存活时间长短都是最好的。但是当激素质量浓度继续增大到NAA4.00mg/L+BA0.4mg/L时,叶愈伤组织质量变差,这说明愈伤组织诱导受到了抑制(见表4)。从表4中还可以看到,在改良MS附加NAA和BA的质量浓度低于NAA0.40mg/L+BA0.08mg/L时,尽管愈伤组织的颜色和致密度都正常,但愈伤组织的发生量少,而且愈伤组织形成的速度也慢,不适于作为愈伤组织分化培养基。2.2不确定芽苗的再生2.2.1d后愈伤组织的增殖从外植体上诱导产生的愈伤组织转接到分化培养基上,5~7d后所有愈伤组织均在愈伤组织块的边缘产生出新的浅绿色呈粒状的无性胚性组织,愈伤组织在分化培养基上均有不同程度的增殖,茎段的愈伤组织再分化显然为有效再分化。2.2.2茎尖的色薄膜对根据表5,5号和10号2个培养基上培养的茎段愈伤组织有不定芽的分化,并逐渐长成丛生苗。其中以5号培养基(1/3MS+BA3mg/L)转接14d后在愈伤组织表面见一突起,外包无色薄膜,2d后露出幼芽,之后幼叶展开,茎尖明显可见。后14d从愈伤组织侧翼又长出3枚芽,再后又围绕中间的芽长出9个芽,并开始生长形成丛生芽苗。1个月后苗高生长0.2~0.9cm,先长出的芽苗生长快。10号培养基(1/3MS+BA2mg/L)转接后10d左右在愈伤组织上形成一个小突起,经过3~5d长大成芽,7~9d后从芽苗基部长出数个小芽,呈丛生状。1个月后最高长到1.5cm。以上2个培养基的不定芽诱导率分别为42%和38%;10号培养基虽然芽苗诱导率低于5号,但芽苗生长良好,故选用该培养基作为不定芽分化的最佳培养基。3诱导愈伤组织的培养基(1)改良MS培养基适宜作欧李茎、叶诱导分化愈伤组织的基本培养基。供试处理均能产生愈伤组织,但愈伤组织产生的快慢和质量不同。附加生长素和细胞分裂素的组合使用比单一附加生长素的愈伤组织发生快、质量好。(2)实验结果表明,叶诱导愈伤组织的培养基以附加NAA和BA效果较好,茎段诱导愈伤组织以附加2,4-D和BA为好,说明不同的器官诱导愈伤组织对激素的需求是不同的。诱导愈伤组织的各种处理都表明,在一定质量浓度范围内随着附加激素浓度的升高,愈伤组织增多,质量渐好,但