大孔吸附树脂在中药分离纯化中的应用

大孔吸附树脂在中药分离纯化中的应用

1总结1.1中药治疗及保鲜大孔吸附树脂是一种具有多孔三维结构的大孔视网膜吸附剂。根据离子交换树脂和其他吸附剂的应用，研制了一种新的树脂。在吸附分子之间的范德华力和氢键的基础上，它依赖于表面的巨大比面。具有大的比表面积和类似活性炭颗粒的内细孔结构,这些多孔特性使之从水溶液中有效地吸附有机化合物,且具选择性吸附能力。目前,全球“回归自然”的热潮正在兴起,人们日益重视天然产物的研究,越来越多的人采用中药治疗。国际中药市场每年销售额160亿美元,其中日本和韩国分别占80%和10%,而我国作为中药发源地和中药材大国,在国际市场上仅占3%,其主要原因是我国中药开发投资不足,产品质量未能与国际接轨。目前我国中药产品多以三、四类药物为主,剂型落后,品种少,远落后于西药制剂。随着科学技术的高速发展和中药现代化发展战略的提出,要求研制出新型中药,这对中药分离、纯化提出了很高的要求。传统的水提醇沉等方法已远远满足不了要求,不能适用于工业大生产。新的分离纯化方法中以大孔吸附树脂最受中药开发者青睐,它具有效果显著、工艺简单、再生方便、生产成本低等优点,可用于中药及天然药物中生物碱、黄酮、萜类、皂苷、内酯、蒽醌、醌类、有机酸、肽、蛋白质及多糖类等活性成分的富集、分离、纯化,它们的吸附性能、吸附条件参数因化合物的理化性质不同而不同。应用大孔吸附树脂分离纯化中药有效成分的类型列于表1中。1.1.1大孔吸附树脂技术的优缺点(1)原生药种,仅以溶液和水煮法聚氧法制备经大孔树脂吸附处理后得到的精制物可使药效成分高度富集,杂质少,仅为原生药的2~5%,水煮法为20~30%,醇沉法为15%。可见,剂量缩小杂质少了,有利于制成现代剂型的中药,便于质量控制。(2)中药生产及贮藏期间存在的问题传统工艺制备的中成药大部分有较强的吸潮性,是中药生产及贮藏中长期存在的难题。经大孔树脂吸附处理后,可有效地去除水煎液中大量的糖类、无机盐、黏液质等吸潮成分,可增强产品的稳定性。(3)约包装,降低成本免去了静置沉淀、浓缩等耗时多的工序,节约包装,降低成本,为中药进入国际市场创造了条件。大孔吸附树脂技术的缺点是树脂价格昂贵、吸附效果受流速和溶质浓度影响。1.1.2分离条件的确定了解大孔吸附树脂的分离原理、特性及结构的基础上,必须根据所分离物的结构、特征来确定分离条件,才能达到较好效果。要达到理想的分离效果,需考虑6点影响因素。(1)黄酮含量的优化大孔树脂的极性和空间结构(孔径、比表面积、孔容)是影响吸附性能的重要因素。根据类似物吸附类似物的原理,化合物体积越大,其吸附力越强。麻秀萍等研究了10种大孔吸附树脂对银杏黄酮的吸附性能及动力学过程,结果表明,银杏黄酮分子量为760,通过筛选,得出弱极性树脂AB-8效果最好。杨桦等探讨大孔吸附树脂提取分离川草乌中总生物碱的工艺,认为弱极性或非极性树脂效果较好。(2)银杏总黄酮的吸附被吸附化合物的分子量大小和极性的强弱直接影响到吸附效果。极性大的分子适于在中极性树脂上分离,极性小的分子适于在非极性树脂上分离。如果树脂和化合物间能发生氢键,吸附作用也将加强。麻秀萍等用极性的S-8、弱极性的AB-8和非极性的H107吸附分离银杏总黄酮时,S-8和AB-8的吸附量很大,分别达126.7mg/g、102.8mg/g,而H107只有47.7mg/g。这是由于银杏黄酮具有多酚和糖苷链,具有一定的极性和亲水性,有利于弱极性和极性树脂的吸附。有机物通过树脂的网孔扩散到树脂网孔内表面而被吸附,因此吸附能力与分子体积密切相关,大分子化合物选择较大孔径的树脂。例如,银杏总黄酮分子量为760,分子体积较大,用孔径较大的S-8(孔径为28.0~30.0nm)进行吸附,吸附量为126.7mg/g,而使用孔径较小的D4006时,吸附量仅为19.0mg/g。(3)无机盐对人参皂苷的吸附①无机盐的影响通常一种成分在某溶剂中溶解度大,则在该溶剂中,树脂对该物质的吸附量就小,反之亦然。故在上样溶液中加入适量无机盐(如氯化钠、硫酸钠、硫酸铵等)可使树脂的吸附量加大。如用D101吸附分离人参皂苷时,若提取液中加入3%的无机盐,不仅能加快对人参皂苷吸附速率,且吸附量明显增大,这是由于加入无机盐降低了人参皂苷在水中溶解度,使其更容易被树脂吸附。②溶剂pH值酸性化合物在酸溶液中吸附,而碱性化合物在碱溶液中吸附较为合适,中性化合物在近中性溶液下被吸附。例如,将黄岑素、葛根总黄酮的碱水溶液在D型树脂上进行吸附,其吸附作用很弱,而在中性及酸性下,树脂对其吸附量增大。用D140型树脂吸附分离银杏总黄酮时,随着pH值的增加,吸附量增加,但到pH4.0以后,吸附量则随着pH值的增加而减小,最适pH值为3~4。(4)绿茶浸提液中茶多酚的吸附大孔吸附树脂吸附量一般与上样溶液浓度成反比,通常以较低浓度吸附较为有利,浓度偏高,则吸附量会显著减小。用NKA-9对绿茶浸提液中的茶多酚吸附分离时,随上样溶液中茶多酚浓度的增加(分别为10mg/mL,15mg/mL,20mg/mL)吸附量逐渐降低(分别为30.3mg/mL,29.4mg/mL,26.5mg/mL)。故上柱之前应对样品浓度进行稀释。(5)银杏黄酮溶液的吸附流速与树脂的孔径、孔容、粒度、吸附物质分子结构及浓度、操作温度等因素相关。吸附流速过大,树脂的吸附量就会下降。例如,对同一浓度的银杏黄酮溶液,用D140进行吸附,吸附流速分别为1BV/h、2BV/h、3BV/h(BV柱床体积),其吸附率分别为56.14%、53.79%、51.97%。但流速过小,吸附时间就会增加。在实际应用时,既要使树脂的吸附效果好,又要保证较高的工作效率。(6)洗脱溶剂与洗脱速率①洗脱剂种类常见的洗脱剂有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等,在实际工作中,乙醇应用较多,可根据吸附量强弱选用不同的洗脱剂及浓度。对于非极性树脂,洗脱剂极性越小,其洗脱能力越强;对于中极性及极性树脂,则用极性较大的洗脱剂为宜。例如,用不同浓度的乙醇对芍药苷进行梯度洗脱,发现10%、20%乙醇洗脱液中均含有芍药苷,而浓度在30%以上的乙醇洗脱液中未检出,故选用20%乙醇洗脱液即可将芍药苷全部洗脱下来。再如,唐第光等探讨了大孔树脂提取三七皂苷,认为水能洗除蔗糖,50%乙醇则能溶解三七皂苷,而70%乙醇洗脱液中几乎不含任何加入物,90%乙醇则较好地洗除β-谷甾醇。②洗脱剂的pH值洗脱剂的pH值对其洗脱能力有显著影响。通过改变洗脱剂pH值,可使吸附物形成较强的离子化合物,很容易被洗脱下来,从而提高洗脱率。例如,黄连生物碱若用50%、70%、100%甲醇洗脱,小檗碱的回收率低,为24.31~83.46%,若先用氨水调pH12以上,加到D101柱上,用pH11水洗,再用含0.5%H2SO4的50%甲醇洗脱,则小檗碱的回收率可达100%。③洗脱流速一般控制在0.5~5mL/min为宜。例如,用50%乙醇洗脱毛冬青总皂苷时,流速为1.5mL/min;用50%乙醇洗脱川乌总生物碱时,流速为3mL/min。随着中药现代化的不断深入和中药新药研发的发展,大孔吸附树脂已广泛应用于中药及天然药物提取液中有效成分的分离和纯化。大孔吸附树脂是一种有机高聚物吸附剂,具有选择性吸附有机化合物的能力,有吸附容量大,解吸容易,再生简便等特点,现已被广泛应用于天然产物的分离和富集。用树脂分离纯化中药及中药复方已成为一种趋势,但应明确纯化的目的,充分考虑采用树脂纯化的必要性和方法的合理性,尤其是复方混合提取的上柱纯化。一般情况下,仅用一个指标、一种洗脱溶剂是不容易达到纯化效果的。应根据处方组成、复方成分,尽可能以每味药的主要有效成分为指标监控各步纯化分离过程。有时,为保证纯化前后药物的等效性,还应配合主要的药效学对比试验进行控制和评价。1.2d-108树脂预处理法市售商品树脂均为化工树脂,含有未聚合的单体、致孔剂、分散剂和交联剂等有机溶剂,如苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯、二乙苯及一些直链烷烃等,都有不同程度的毒性,不仅造成药品的不安全,还影响树脂的吸附性能。用前必须预处理,除去树脂中有机残留物。国家食品药品监督管理局(SFDA)已规定树脂有机残留物的限量检查标准。树脂预处理方法有回流法、渗漉法和水蒸汽蒸馏法等,所采用的溶剂主要有乙醇、甲醇、异丙醇及稀盐酸、稀氢氧化钠溶液等。目前预处理方法大多采用渗漉法,即将树脂装柱,加有机溶剂浸泡,洗脱,再浸泡,再洗脱,加2%盐酸溶液浸泡,洗脱,水洗至pH值中性,加2%氢氧化钠溶液浸泡,洗脱,水洗至pH值中性。该方法溶剂用量为10~20BV,预处理周期为3~5d,不仅成本高、时间长、效果差,且环境污染也大。D-101是以苯乙烯为结构骨架,以二乙烯苯为交联剂聚合而成,是目前使用最广泛的树脂之一。为降低D-101预处理成本,提高效率,贾存勤等对D-101预处理方法进行了系统研究,对有机残留物进行了检测,并用紫外可见分光光度法建立了快速监测方法。2大孔吸附树脂在生物分离和提取中的应用2.1大孔吸附树脂对天麻氧化酶的分离纯化生物碱包括川乌,草乌生物碱,黄柏总生物碱,黄连中小檗碱,麻黄碱,川芎总生物碱,氧化苦参碱等,这里重点介绍大孔吸附树脂对麻黄生物碱的分离纯化。2.2大孔吸树脂法分离纯度麻黄总碱活性物质2.2.1及其提取方法麻黄为麻黄科植物草麻黄EphedrasinicaAtapf的地上部分。具有发汗、解热、镇咳、治喘、利水功效,临床上主要用于治疗风寒感冒、恶寒发热、急性肾炎、支气管炎等症。黄连根茎含多种生物碱,其主要有效成分为L-麻黄碱(L-ephedrine);其次为D-伪麻黄碱(D-pseudoephedrine)。现代药理学试验表明,麻黄碱对支气管平滑肌有松弛作用,其总生物碱具有明显的平喘、发汗、利水等作用。麻黄碱提取方法有多种,如水蒸汽蒸馏法、水浸煮-甲苯提取法,前者蒸馏时部分麻黄碱会分解损失;后者设备简便得率高,但要使用甲苯等有毒溶剂;以大孔吸附树脂纯化富集的效果明显优于上述方法。2.2.2大孔吸附树脂，纯度提取麻黄碱2.2.3树脂-药材比值对麻黄碱回收利用的影响(1)麻黄醇提液的pH值约为5,在弱酸性下,麻黄碱在树脂上吸附力较弱,极易穿透树脂床,造成麻黄碱的泄漏。pH值越高,越有利于吸附。因此,上样前需调最佳吸附pH值至11.0,增加麻黄碱的吸附,减少泄漏。吸附要有一个过程,上柱流量不能过快,以4BV/h体积流量,即可保证麻黄碱较高的保留率。(2)用水洗涤饱和树脂时,为清洗杂质不至于造成麻黄碱的过多流失,清洗液流量不宜太快,以2BV/h为宜。树脂-药材比值不宜过小,一般以4:1。选用0.08mol/LHCl溶液作为D151、XAD-7大孔树脂的洗脱剂,流速控制在4BV/h,可达到较好的洗脱效果。(3)如采用XAD-4大孔树脂吸附,则宜用0.02mol/LHCl与甲醇1:1混合液作为洗脱剂,3种树脂回收率均在90%以上,纯度在80%以上。本法一次吸附提纯倍数为15~19倍。3孔内吸附树脂黄酮分离纯度的应用3.1大孔吸附树脂对根总黄酮的分离纯化黄酮类包括红花黄色素,黄芩总黄酮,葛根总黄酮,肿节风黄酮,槲皮苷黄酮,降香总黄酮,菟丝子黄酮等,这里重点介绍大孔吸附树脂对葛根总黄酮的分离纯化。3.2采用大孔吸树脂法分离葛根总黄酮3.2.1葛根素的药代动力学葛根为豆科植物野葛PuerariathomsoniiBenth的根,为常用中药,具有调节血压、增加冠脉血流量、改善脑循环、抑制血小板聚集、抗氧化自由基等作用。临床应用于冠心病、脑血栓均取得了明显疗效。葛根主要有效成分为大豆素、大豆苷、葛根素等总黄酮,由于葛根粉中葛根素的含量远远低于野葛根,从而大大限制了葛根粉的药用。目前有利用野葛根分离得到葛根素的报道,但大多采用酸水解法或溶剂萃取法,前者虽可得到高含量葛根素,却破坏了其他药效成分。有报道采用大孔吸附树脂,仅通过“吸附-脱附”一步的简单工艺即可从葛根粉中得到较高含量的葛根素。3.2.2采用大孔吸附树脂法分离一般葛根黄酮3.2.3中提取出白砂糖糖基的活性(1)将葛根药材进行预处理,50%乙醇回流提取2次(2h,1.5h),制成葛根总黄酮醇提液,用水稀释后上柱;以1BV/h上柱流速,LSA-10大孔吸附树脂能有效地吸附葛根总黄酮。(2)葛根素的分子结构有一个极性糖基和一个非极性黄酮母核,呈弱酸性,同时又具有酚羟基结构,可作为良好的氢键供体。中极性吸附树脂LSA-10具有较低的比表面积,但带有孤电子对的羰基官能团,羰基是良好的氢键受体,能与葛根素形成氢键作用,从而大大提高了吸附选择性。(3)上柱量过少,使周期过长,树脂与药液的比为1:4;饱和树脂先以2BV/h水洗涤,除去多糖类等杂质,后以4BV50%乙醇洗脱,控制流速0.5BV/h,收集乙醇洗脱液,减压浓缩后即得葛根总黄酮干膏。(4)用8BV的50%乙醇可将吸附在树脂上的样品洗脱下来,经LSA-10纯化后葛根总黄酮得以富集并提高了纯度,吸附树脂法分离葛根素收率高、成本低、操作简便、易于工业化生产。4孔内吸附树脂在类分离中的应用4.1大孔吸附树脂对北药体的分离纯化萜类包括北五味子配糖体,京尼平苷,京尼平苷酸,杜仲中松脂琼二葡萄糖苷,秦艽中龙胆苦苷等,这里重点介绍大孔吸附树脂对北五味子中的配糖体的分离纯化。4.2大孔吸树脂法分离了北五味子中的糖合物4.2.1质、酯类、活性成分及提取物北五味子[Schisandrachinensis(Tarez.)Baill.]主产于我国东北,故又称“辽五味”。药用干燥成熟果实,其功效为收敛固涩、益气生津、补肾宁心,用于肺喘虚咳、心悸失眠诸病。北五味子的化学成分研究比较深入,其组分中含有木脂素、三萜、倍半萜(倍半蒈烯sesquiearene、β-花柏烯及衣兰烯)、有机酸(柠檬酸12%、苹果酸10%及少量酒石酸)、挥发油3%及多糖等成分。北五味子的水提醇沉提取物是复方生脉注射液的组成部分之一。中科院昆明所与中科院上海药物所王逸平教授合作的药理筛选表明,北五味子的水提醇沉提取物在心血管方面显示较强的活性,在深入研究过程中,又从其果实的水提醇沉提取物中用大孔吸附树脂分离到5个配糖体。4.2.2大孔吸树脂法分离出北五味子果实的水提取物提取过程4.2.3洗脱、浓缩法(1)D-101大孔树脂能有效地吸附北五味子干果实的水提醇沉提取物,饱和树脂先用水洗涤,后用甲醇洗脱,收集甲醇洗脱液,浓缩后上硅胶柱层析,以氯仿:甲醇:水(7:3:0.5)进行洗脱,收集层析洗脱液。(2)将第3、4和5流分,再经反复硅胶、RP-C18和SephadexLH-20反复柱层析,分离得到化合物I、II、III、IV、V等5个配糖体。5大孔吸附树脂对肥皂和纯度的分离5.1大孔吸附树脂对三七皂苷的分离纯化皂苷包括三七皂苷,人参总皂苷,麦冬总皂苷,红景天苷,威灵仙总皂苷,蒺藜总皂苷,柴胡总皂苷等,这里重点介绍大孔吸附树脂对三七皂苷的分离纯化。5.2大孔吸树脂分离纯度为三七醇5.2.1改种成分的活性成分三七系五茄科植物三七PanaxnotoginsengB.F.H.Chen的干燥根,具有化瘀止血、活血定痛之功效,中医临床多用于冠心病、心绞痛的治疗。主要含有皂苷、黄酮、甾醇、多糖等成分,其中三七皂苷是主要活性成分。三七含28种皂苷,以人参皂苷Rg1,Re,Rb1和三七皂苷R1的生理活性较为明确。随着吸附分离技术的广泛应用,D101型大孔吸附树脂纯化三七皂苷的报道很多,但都局限于三七总皂苷的提取,不能反应三七总皂苷的组成。欧来良等根据三七皂苷的结构特征,选用强极性吸附树脂ADS-2,以50%乙醇为洗脱剂,产品中有效成分含量为:人参皂苷Rg131.7%,Re5.40%,Rb15.79%,三七皂苷R129.7%,产率为7.75%,探索了一种高效、实用的分离纯化三七皂苷的技术,方法简单、可行,易于工业化生产。5.2.2大孔吸附树脂abs-2分离37v污泥的过程5.2.3sd-2-爱氧法(1)三七粗粉预处理后,20倍量70%乙醇80℃回流提取2次(3h;2h),合并滤液,减压回收乙醇,过滤制成三七澄清提取液,水稀释后,以1.5BV/h吸附流速上柱;ADS-2大孔强极性吸附树脂带有少量可交换功能基,能有效地吸附三七中较大极性的达玛烷型皂苷。(2)ADS-2与药液比例为1:4;饱和树脂先用水洗涤至中性,再用4BV的50%乙醇可将三七皂苷洗脱下来,收集洗脱液,解吸峰非常集中,洗脱率达95%以上,减压浓缩后即得白色三七皂苷产品。(3)经ADS-2纯化后,三七皂苷总固体物得以富集并大幅度提高了纯度。该法具有产品色泽好,生产过程中不用毒性有机溶剂,对产品、环境无污染,利于工业化生产等优势。(4)利用HPLC对三七皂苷中人参皂苷Rg1,Re,Rb1和三七皂苷R1进行了定量分析,有效成分含量分别为:人参皂苷Rg131.7%,Re5.40%,Rb15.79%,三七皂苷R129.7%。6孔内吸附树脂在去除和提取内容的应用6.1大孔吸附树脂对银杏酯、糖酯、白砂糖li的分离纯化内酯、蒽醌类包括银杏内酯和白果内酯,倍半萜内酯A、B,决明子蒽醌苷元,虎杖中白藜芦醇等,这里重点介绍大孔吸附树脂对银杏内酯和白果内酯的分离纯化。6.2用大孔吸附树脂分离银杏内核和白术内核6.2.1血小板聚集诱导剂银杏内酯是天然植物药开发热点之一。银杏叶的主要活性成分,有银杏内酯(ginkgolide)A、B、C、J、M和白果内酯(bilobalide),前者为二萜内酯化合物,后者具有互相稠合在一起的4个五元环,其中之一个五元环上连有天然产物中罕见的叔丁基,结构见图1。它们均为强血小板活化因子(platelet-activatingfactor,PAF)受体拮抗剂,血小板活化因子是由血小板和多种炎症组织分泌产生的一种内源性磷脂,是迄今最有效的血小板聚集诱导剂,目前被认为是最有临床应用前景的天然血小板激活因子受体拮抗剂。其中尤以银杏内酯B的活性最强,药用价值最大,有望成为治疗休克、烧伤、过敏性哮喘、中风、移植排斥、血液透析等病症的一类新药,因而引起世界制药工业界的极大兴趣。从银杏叶或银杏浸膏中提取银杏内酯和白果内酯的方法,采用溶剂萃取法和柱色谱法,已得到纯度95%以上的银杏内酯A、B和白果内酯的单一产品。即先用萃取法得到内酯含量达80%以上,再采用柱色谱法,即得单一产品。但硅胶具有不可逆吸附性,造成了大量样品的损失。大孔吸附树脂具有成本低、效率高、稳定性好、容易再生等特点,有研究报道,选择国产树脂HPD-100、HPD-400、NKA-II、AB-8、LSA-10、BS-556种不同型号的大孔树脂,对银杏内酯A、B和白果内酯进行分离,实践证明,LSA-10、AB-8和HPD-1003种大孔树脂可达到分离纯化单一内酯的目标。6.2.2用大孔吸附树脂分离银杏和白芍的过程(2)hpd-100的制造工艺-26.2.3ab-8树脂吸附na、nka-9、d4020、dm-133活性树脂①银杏浸膏经预处理得到银杏内酯混合物(含银杏内酯A、B及白果内酯,分别用GA、GB、BB表示)。其中GA、GB、BB的含量分别为44.2%、33.2%和16.2%,3种成分总含量为93.6%。用AB-8树脂吸附,上柱液浓度4mg/mL,70%甲醇液吸附率最大。②韩金玉等比较了AB-8、NKA-9、D4020、ABD-4和DM-1305种大孔树脂对银杏内酯和白果内酯的吸附及解吸性能,结果表明,AB-8是较适宜的吸附剂,不仅吸附量较大,而且解吸率高于其它树脂。③分别选用30%乙醇、无水乙醇、60%甲醇、无水甲醇和丙酮作为脱附剂对饱和树脂进行解吸,结果表明,以无水甲醇的脱附效果大大优于其它脱附剂。(2)银杏内酯干膏①银杏浸膏经预处理得到银杏内酯混合物(含银杏内酯A、B、C及白果内酯,分别用GA、GB、GC、BB表示)。其中GA、GB、GC、BB的含量分别为30%、15%、3%和20%。②仝燕等报道,HPD-100树脂与生药的最佳比例为1:1(mL/g);饱和树脂先用水洗涤,再用10%、20%乙醇洗涤至近无色后,用4倍量60%乙醇可将银杏内酯洗脱下来,收集洗脱液,减压浓缩,60℃真空干燥3h后即得银杏萜内酯粗提物干膏。③银杏萜内酯粗提物经含量测定,含白果内酯5.7%、银杏内酯A4.5%、银杏内酯B2.1%、银杏内酯C2.9%,粗提物总内酯为15%,同时含有35%银杏黄酮。进一步精制只需用很少量的乙酸乙酯萃取或乙醇水溶液重结晶,即可制得纯度达95%以上的白果内酯,银杏内酯A、B、C单体。7大孔吸附树脂在有机酸、碱类分离中的应用7.1大孔吸树脂法