好氧反硝化菌研究进展

好氧反硝化菌研究进展

随着工业和社会经济的快速发展，自然界中氮素的平衡逐渐受到打破，这不仅造成了严重的污染和经济损失，而且还危及人类健康和生态安全。因此，国内外研究人员分别发现了生物脱氮率高、稳定等特点，并建立了传统的生物硝化反硝化理论。传统理论认为，生物脱硝反应以两种反应相结合的速度完成，反应后阶段需要相应的功能微生物和严格的环境条件：在好氧条件下，将氨氮转化为硝氮和硝氮。然后，在缺乏或厌倦氧气的条件下，异质异族环胞将硝氮转化为气物质产品。其中，研究人员普遍认为，只有在缺乏和氧气的条件下，抗硝化酶系统才有效，生物反硝化过程才能正常进行。然而,1980年Meiberg等在HyphomicrobiumX氧化二甲胺/三甲胺过程发现,该菌株在好氧条件下具有反硝化功能.随后,Robertson等在废水脱硫和反硝化系统中首次分离出一株好氧反硝化菌Thiosphaerapantotropha(现名脱氮副球菌Paracoccusdenitrificans),该菌株在利用氨氮过程中未出现明显的亚硝氮积累,具有同步异养硝化与好氧反硝化功能.此后,陆续有文献报道从不同环境样品及废水处理系统中分离筛选出大量具有好氧反硝化功能的微生物,为同步硝化反硝化生物脱氮新技术奠定了基础[4~11].本文即综述了国内外已筛选分离的主要好氧反硝化菌类群及其生长特性,重点阐述了好氧反硝化的作用机理、影响因素以及其在环境生物修复中的应用,并对今后的研究与应用方向作了展望.1废水脱硫废水的预处理好氧反硝化菌(Aerobicdenitrifier)是一类在有氧条件下利用周质硝酸盐还原酶(Periplas��icnitratereductase)等好氧反硝化酶进行脱氮反应的异养微生物,其分布广泛,可适应多种生境,多为好氧或兼性好氧.迄今为止,已分离获得大量具有好氧反硝化功能的菌株(表1),主要分属副球菌属(Paracoccus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、产碱杆菌属(Alcaligenes)和芽孢杆菌属(Bacillus)等.目前,研究报道较全面的菌种包括最早从废水脱硫和反硝化处理系统分离获得的T.pantotropha(P.denitrificans),从猪场养殖废水分离获得、可耐受92%高浓度氧分压的PseudomonasstutzeriSU2[13~14],从处理猪场废水活性污泥系统分离获得的AlcaligenesfaecalisNo.4[15~17],以及从脱氮除磷活性污泥和环境样品中均分离得到的Microvirgulaaerodenitrificans[18~19].2氧漂后氧化应环境参数ld50与传统的反硝化细菌相比,好氧反硝化菌具有以下生长特性:1)有氧生长,大多数菌种可耐受3mg/L以下的溶解氧,部分菌种在高氧气分压下也具有反硝化活性,少数可耐受5~6mg/L溶解氧浓度(表1);2)大多好氧反硝化菌同时具有异养硝化及代谢难降解有机物的能力;3)生长周期短,生长速率远大于自养菌,例如文献报道Nitrosomonaseuropaea的最大比增长速率约为0.03~0.05h-1,而在同等生长条件下T.pantotropha的最大比生长速率高达0.4h-1,有效弥补了其异养脱氮活性相对较低的缺陷;4)环境适应性强(pH、DO等条件),对高浓度有机物和氮的耐受力强;5)反硝化气态产物一般为氧化亚氮(N2O),少数为氮气(N2).3对氧分子的影响为更好地阐明好氧反硝化过程机理及强化其脱氮过程的关键因子,研究者分别从降解酶系统、电子呼吸链等角度对部分模式菌株进行了功能研究.从两种反硝化菌的酶系统考虑,研究者分析发现整个反硝化过程涉及到4种还原酶,分别为硝酸盐还原酶(Nitratereductase,Nar)、亚硝酸盐还原酶(Nitritereductase,Nir)、一氧化氮还原酶(Nitric--oxidereductase,Nor)和一氧化二氮还原酶(Nitrous--oxidereductase,Nos).相比厌氧反硝化菌,好氧反硝化菌的细胞内存在不受溶解氧抑制的反硝化酶系统(图1).研究表明菌株的好氧反硝化能力与其特殊硝酸盐还原酶的表达密切相关.硝酸盐还原酶(Nar)具有两种不同的形式:一种是膜结合硝酸盐还原酶(Membrane-boundnitratereductase,M-Nar),它在厌氧环境优先表达,但对氧分子敏感,有氧条件下其活性易受抑制;另一种周质硝酸盐还原酶(Periplasmicnitratereductase,P-Nar)则具有较强的耐氧能力.从电子呼吸链角度来看,Robertson等研究认为厌氧反硝化时电子在向氧原子传递的过程中存在“瓶颈”(图1),而在好氧反硝化过程电子可在细胞色素c(Cytc)和细胞色素aa3(Cytaa3)传递从而解除氧气对反硝化电子呼吸链途径的抑制,使得过剩的还原力通过周质硝酸盐还原酶传递给硝酸盐(NO3-),将其还原为亚硝酸盐(NO2-).此外,T.pantotropha可诱导或使用额外的细胞色素,则电子同时在多条细胞色素支链流动,从而打破“瓶颈”,使其可在不同底物条件下生长增殖.Kong等提出好氧反硝化菌中可能存在一种能以醌氢类(QH2)为电子供体、不受氧分子抑制的硝酸盐还原酶(Oxygenresistednitratereduetase,orNar),以及一种以细胞色素bc1(Cytbc1)为电子供体且不受氧分子抑制的亚硝酸盐还原酶(Oxygenresistednitritereductase,orNir),从而在有氧条件下可将醌类的电子传递给硝酸盐分子将其还原,同时接受Cytbc1的电子生成NOx完成整个呼吸过程.此外,Chen等从电子分配角度研究了Pseudomonasaeruginosa好氧反硝化过程电子受体——氧和硝酸根的竞争影响,发现反硝化过程接收每个电子的能量得率是氧气呼吸途径的69%.只有在较低溶解氧条件下(<0.05mg/L),增大溶解氧方能促进有氧呼吸,溶解氧的增大只微弱增强其对反硝化的抑制,厌氧时菌株的表观细胞得率明显减小,缺少NO3-或O2都会降低其生长率和反硝化率.可见,好氧反硝化菌包含两种硝酸盐还原酶,反硝化和有氧呼吸系统并存,NO3-和O2同时被还原,反硝化作用则可能以电子受体的角色与有氧呼吸形成辅助或竞争关系.明晰了好氧反硝化过程途径及机理,有助于我们从酶系统、电子呼吸链及基因角度,优化获得更高效的好氧反硝化菌筛选方法.现有文献报道的好氧反硝化菌的筛选方法主要有施加一定选择压(如间歇曝气)或采用选择性培养基驯化富集,而高效的菌种筛选方法是微生物强化技术应用的关键.Carter等依据周质及膜结合硝酸盐还原酶生化特性的严格区别,利用还原性甲级紫精(MV+)和还原性苯甲基紫精(BV+)分别作为电子供体,以区分周质和细胞质中硝酸盐还原酶的活性位点,采用此种方法在4种环境样品中筛选到多种好氧反硝化功能微生物.孔庆鑫等利用氰化钾(KCN)作为呼吸抑制剂,终止呼吸链中电子由细胞色素aa3(Cytaa3)向氧的传递,从而抑制氧作为电子受体的呼吸反应,同时结合曝气状态下氧分子对相关酶的表达或活性的抑制,使好氧反硝化菌更易被选择性筛选.4羟胺氧化酶hao,no好氧反硝化系统的存在,使得反硝化菌与硝化菌能够同时生长于好氧环境,在单一构筑物内即可实现同步硝化反硝化,大大节省了工程投资,并在系统碱度维持等方面更具经济性.不仅如此,陆续有研究者发现某些好氧反硝化菌同时具有异养硝化功能,即在有机物存在下通过不同酶系的协同作用完成硝化与反硝化两个过程,将氨氮直接转化为气态产物去除(图2),单一微生物即可完成脱氮过程.Richardson等研究认为同步异养硝化–好氧反硝化的脱氮机理为:在好氧环境下,菌体利用氨单加氧酶(AMO)将氨氮氧化为羟胺,进而在异养硝化菌特有的不含血红素的羟胺氧化酶(HAO)作用下转化为亚硝酸盐或N2O;同时,体系中的硝酸盐在周质硝酸盐还原酶(NAP)等的作用下转变为亚硝酸盐,最终转化为N2O或N2脱除[40~42].但这并不是此类细菌同步异养脱氮的唯一途径.对Alcaligenesfaecalisno.4的研究发现,只有很少的氨氮转化成亚硝氮,主要的反硝化是通过氨氧化而成的羟胺脱除,反应终产物90%为氮气(N2).分离得到的Acinetobactersp.YY-5并不能发生好氧反硝化,但能在3d内将氨氮由95.23mg/L降解至1.29mg/L,降解率达到98.6%,同时未发现亚硝酸盐氮、硝酸盐氮积累,其主要代谢气体产物为CO2和N2,无N2O生成.最近报道的异养硝化菌AcinetobactercalcoaceticusHNR在整个脱氮过程中并无亚硝酸盐及硝酸盐的产生,该菌株不能利用硝酸盐及亚硝酸盐,系统内检测不到硝酸盐还原酶(Nar)和亚硝酸盐还原酶(Nir),氨单加氧酶(AMO)、羟胺氧化酶(HAO)在该类菌种利用羟胺直接脱除氨氮的过程中可能发挥重要作用.此外,菌株Alcaligenesfaecalisno.4在不同培养条件下均有约40%~50%的氨氮去除率,其中至少一半转化为细胞内的氮储存.Kim等发现PseudomonasputidaAD-21的培养体系中氨氮主要同化为谷氨酸盐被菌体吸收,而硝氮进行反硝化脱除.这些研究表明氨氮主要作为氮源供菌体生长,硝酸盐进行反硝化,同时氨氮的存在能促进细胞生长和反硝化生成N2,防止N2O的积累.5影响生物反应速率的因素在废水生物处理系统中,溶解氧(Dissolvedoxygen,DO)、碳氮比(C/N)、温度和pH是影响生物反应速率的主要因素,如系统DO水平直接影响反硝化有氧呼吸,进水碳氮比(C/N)则关系到碳源利用效率和细胞生长.5.1好氧反硝化菌的筛选如前所述,反硝化过程涉及到4种反硝化酶,其合成和活性均受溶解氧的控制,其中硝酸盐还原酶的耐氧能力最强,而N2O和/或NO的生成几乎可被溶解氧完全抑制,研究证实一氧化二氮还原酶(Nos)的溶解氧抑制浓度低于0.2mg/L,硝酸盐还原酶在DO高于4mg/L时受到抑制.因此,DO浓度影响反应终产物的生成.低溶氧条件下,硝酸盐还原酶的活性较低,会导致细胞生长率和反硝化率降低,硝酸盐还原酶则处于休眠状态,但有利于N2生成.高溶解氧条件下,聚-β-羟基丁酸(Poly-β-hydroxybutyrate,PHB)得以积累利于快速脱氮,较易发生同步硝化反硝化(SND).但也有研究者认为好氧反硝化作用的启动并不依赖于相关酶系对氧气的敏感程度,而是与调控转录水平的氧气或氧化还原的敏感因子有关.通常筛选分离到的好氧反硝化菌具有一定的溶解氧阈值,当DO浓度高于该值时对该菌种的反硝化效果有抑制作用.如表1所示,大多数好氧反硝化菌可耐受3mg/L以下的溶解氧,部分菌种在高氧气分压下仍具有反硝化活性,可耐受5~6mg/L溶解氧[20~21].对Pseudomonassp.C3的研究表明,溶解氧对反硝化基本没有抑制作用,在DO为2.3~11.3mg/L范围内,该菌株都可以选择硝酸盐作电子受体.上述好氧菌株的发现更利于好氧反硝化优势的体现.同时研究表明,多数好氧反硝化细菌属兼性细菌,可同时表达周质及膜结合硝酸盐还原酶活性,因此周期性好氧/厌氧环境交替有利于其富集成为优势菌.Patureau等研究发现施加一定的选择压(间歇曝气)进行驯化,好氧反硝化菌可得到有效富集.对溶解氧转变的适应性使其能更好应用于溶解氧波动的情况下,消除过剩还原性物质.好氧菌株反硝化相关酶系的永久表达避免了普通反硝化菌在一段缺氧后重新诱导,对曝气条件变化能快速适应,具有很好应用潜力.5.2碳源对好氧反硝化菌活性的影响有机碳源在整个脱氮过程中发挥重要作用.研究表明,好氧反硝化菌可利用碳源范围较广,包括某些难降解有机物.在对有限资源进行竞争时,混合营养(Mixotrophy)是决定菌种能否在竞争中取胜的重要因子,代谢的灵活性和反应性在物种竞争中也占有重要作用.因此,可利用基质的多样性使得好氧反硝化菌在系统中具备一定竞争优势.有关文献报道中,研究C/N对好氧反硝化菌影响的范围较广,在2~24之间(表1).有研究表明C/N在2~12之间,C/N越大则反硝化效果越好.分析其原因,高C/N能够保证充足的碳源使反硝化作用更彻底,同时周质硝酸盐还原酶的基因调控蛋白FNR对氧化还原反应敏感,相对较高的C/N激活了好氧反硝化菌相关反硝化基因的表达.而低C/N时,碳源快速消耗,会造成硝化与反硝化之间的不均衡.另有部分研究结果显示,对特定菌株,在较小范围内即存在最佳C/N值,此时的碳源浓度刚好能诱导足够反硝化酶,继续增加碳源其反硝化活性不会继续增大.如Huang等认为在1~7范围内,C/N值为5是Citrobacterdiversus的最适碳氮比,高C/N下总体氮去除率增加但大多用于菌体合成而被消耗.Bernat等研究证实在好氧条件下的活性污泥可利用细胞内PHB做唯一碳源进行反硝化,外加乙酸盐作为碳源时,其好氧反硝化活性得到明显提升.对细胞内碳源的有效利用,为低碳氮比废水的有效处理也提供了一条新的途径.研究筛选适宜低C/N的好氧反硝化菌种,可针对特定水质发挥其应用优势.5.3ph和温度对发酵及风味的影响对Pseudomonassp.C3的好氧反硝化性能的研究发现,pH值对其反硝化能力影响显著.不同pH值下,反硝化效能不同.在中性及偏碱(pH7~9)的条件菌株C3有较好的反硝化效果(脱氮率59%~93%),但在酸性(pH≤6)和强碱性(pH≥10)的条件下,菌株生长状况差,对硝酸盐基本没有多少去除.研究表明pH对土壤中ParacoccusdenitrificansNOx还原酶基因的表达及反硝化作用模式有较大影响,在pH6~7.5的范围内,次佳pH条件会抑制N2O的还原,抑制发生在相关蛋白的合成/装配而非转运过程.温度对菌株Pseudomonassp.C3的反硝化效率的影响并不显著,在25~35℃的温度范围内,该菌株都具有很高的脱氮效率.对菌株PseudomonaschloritidismutanX31的研究结果类似.相对较宽的pH和温度范围有利于好氧反硝化菌在环境中的竞争与存活,发挥其反硝化能力.此外,某些金属离子(如二价铁离子Fe2+)的加入可显著提高菌体对NH4+和NO3-的利用效率.Kim等的研究也表明Ca2+、Fe2+和Mg2+等金属离子子对Bacillussp.的生长和脱氮效率有较大影响.6好氧反硝化菌在环境生物修复系统中的应用作为生物脱氮新技术之一的好氧反硝化,其与传统的细菌厌氧反硝化相比具有如下优势:好氧反硝化菌生长速度快、产量高,大多具有同步异养硝化性能,可在同一个系统内完成脱氮过程,大大减少了碱度投加量及构筑物占地面积,具有较好的经济性.同时,多数好氧反硝化菌适应性较强,对DO浓度要求较低,反硝化速度快且彻底,在环境生物修复系统运行中更容易被调控.相比而言,传统自养硝化细菌生长率低,普通反硝化菌对环境因素变化敏感,维持足够菌体数量较难.目前,好氧反硝化菌主要应用于废水生物处理、养殖水体净化等领域.6.1好氧反硝化菌群Pai等将筛选到的好氧反硝化菌种与活性污泥混合后处理污水,取得了很好的强化效果.Bouchez等采用海藻酸包埋技术成功将Microvirgulaaerodenitrificans接种于连续流反应器(CSTR)进行城镇污水处理,菌体可在反应絮体中有效持留.Gupta等采用T.pantotropha强化的三阶旋转生物接触器(Roottaattiinnggbbiioollooggiiccaallcontactor,RBC)处理受高硝氮受污染地下水,该系统无需单独碳氧化调控来强化硝化反硝化效果,反硝化过程的碱度补偿经济性大幅提升.马放等利用好氧反硝化菌群强化生物陶粒反应器处理高浓度含硝氮废水,系统稳定运行后硝氮平均去除率可达93%以上,COD的平均去除率稳定在98%,变形梯度凝胶电泳(DGGE)分析发现好氧反硝化菌在整个运行阶段稳定存在.Patureau等将Microvirgulaaerodenitrificans用于除磷系统强化,并对投加策略与菌体持留进行了研究,结果表明初始碳源的添加与菌体加入量的控制起了关键作用.Barak等研究了有氧条件下Pseudomonasdenitrificans细胞内聚磷酸盐(Poly