微生物酶在发酵酱及酱油中的应用

微生物酶在发酵酱及酱油中的应用

京味素是豆发酵产品中最重要的食品之一。酱起源于我国,可以追溯到公元前几千年,自古以来深受人们喜爱,素有“北方人不可一日无酱,南方人不可一日无豉”之说。早在周朝时期(约2900年前)它的制作就已经很发达了,后来相继传到了越南、日本和其他国家。酱既是调味品,又可当作美味的佳肴,不但营养丰富,而且容易消化吸收。目前,已成为许多国家不可缺少的调味品。酱油是由豆酱衍生而来的,其生产工艺与豆酱相似是一类深受我国各地人民喜爱的调味料。1发酵阶段的酶分解酱、酱油是以豆、麦等粮食为原料,经过蒸煮,使原料的蛋白质适度变性,淀粉适当糊化后制成酱醅,依靠空气中的微生物自然发酵,在适宜的温度下固态发酵一定时间,这时微生物在有氧的条件下极易大量生长繁殖,分泌出各种酶,有蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、果胶酶等。这些酶分解原料中的多种成分,发酵前阶段依靠微生物产酶,并利用这些酶分解大分子物质,主要变化为蛋白质变性,可溶性蛋白和糖的溶出,为后期发酵阶段酵母菌和乳酸菌提供营养。淀粉分解成单糖、双糖及多糖;然后氨基酸与糖类进行美拉德反应,形成棕色色素;后酵阶段,主要是通过乳酸菌及酵母菌的作用产生风味物质。糖被空气中的耐盐型酵母菌和细菌发酵形成醇类及有机酸,并合成酯类的综合过程,从而形成酱、酱油独特的色、香、味、体。2发酵过程中内源酶类的变化发酵过程中的酶按来源可分为3大类:一类是生产中人为添加的游离酶,即外源酶;第二类是发酵过程中各种微生物细胞中所含的酶,即内源酶;第三类是大豆中固有的酶类。由于大豆蒸煮过程中其自身固有的酶已失活,且传统酿造酱及酱油不需要人为添加发酵剂及酶,所以本文主要讨论酿造过程天然微生物分泌的酶类。2.1淀粉酶2.1.1-淀粉酶的生成糖α-淀粉酶(EC3.2.1.1)亦称淀粉1,4糊精酶,是一类能够切开淀粉链内部α-1,4糖苷键的酶,虽然它不能水解淀粉分支点上的α-1,6糖苷键以及作用于分支点附近的α-1,4键,但可以超越α-1,6键而作用于分支链内部的α-1,4键,因此水解产物除麦芽糖和少量葡萄糖外,还产生含有α-1,6键的寡糖.由于生成的糖为α型,故称α-淀粉酶。淀粉颗粒糊化后能被α-淀粉酶分解成小分子的糊精和少量糖分,使淀粉黏度降低,再进一步利用糖化酶即可使短分子的糊精全部变成麦芽糖或葡萄糖。能生产此酶的微生物主要有枯草杆菌、黑曲霉、米曲霉和根霉。2.1.2淀粉酶发生糖代谢糖化酶(EC3.2.1.3)亦称淀粉α-1,4葡萄糖苷酶(Glucoamylase)简称糖化酶(缩写GA或G)。这类酶作用于淀粉分子末端,它是一种外切型糖苷酶,从淀粉非还原性末端顺次切开α-1,4糖苷键,切下一个个葡萄糖单元,生成葡萄糖。并像β-淀粉酶一样,使水解下来的葡萄糖发生构型变化,形成β-D-葡萄糖。它们也能作用于支链淀粉的α-1,6键,但速度较慢,将支链淀粉全部水解成葡萄糖因此分解产物全部为葡萄糖,作用结果使糖的还原能力迅速增高。糖化酶也能微弱水解α-1,3连接的碳链,它一般都能将淀粉百分之百地水解生成葡萄糖。此酶产生菌主要是黑曲霉(左美曲霉、泡盛曲霉)、根霉(雪白根酶、德氏根霉)、拟内孢霉、红曲霉。米曲霉分泌的淀粉酶主要有以上两者,它们共同作用产生葡萄糖,为米曲霉、酵母菌及其他微生物提供了碳素营养,也是酒精发酵、乳酸发酵及谷氨酸发酵的基础物质,还能与氨基酸化合成有色物质。所以,淀粉的糖化程度对酱及酱油色、香、味、体均有重大影响。糖化作用完全,酱油的甜味好,体态浓厚,无盐固形物含量高,可提高酱油质量。2.2黑曲霉属酶系统蛋白酶能够催化蛋白质水解的酶的总称。各种蛋白酶共同的特点是催化分解肽键,使蛋白质降解成为小分子的蛋白胨、小肽或氨基酸等物质。Subramanian等人对酱油中蛋白质分解酶进行了系统的研究和分类(如表1),该表是通过SephadexG-100(一种分离蛋白质专用的分子筛)分离出来的蛋白酶。霉菌生产的蛋白酶在豆酱和酱油生产上的应用已经具有相当悠久的历史。曲霉菌,例如米曲霉、黄曲霉、栖土曲霉等,一般能分泌2～3种蛋白酶(酸性、中性及碱性),其中以中性和碱性酶为主。黑曲酶则以产酸性蛋白酶(最适pH2～5)为主。酱油曲霉所产的蛋白酶也以中性(最适pH7～8)及碱性(最适pH9～11)为主,日本的Hayashi等对其性质做了详细的研究。酱油曲霉蛋白酶具有典型的肽链内切酶特性,一般在消化蛋白质时切断肽链的8%～15%就终止反应。在酱类酿造中,其主要作用是促使大豆蛋白溶解。若将酱油曲霉蛋白酶制成酶制剂应用到酱油生产上,可大大提高生产效率。我国无锡轻工业学院与无锡太湖酱类厂协作,曾采用米曲霉生产蛋白酶并应用于酱油生产,取得了成功。酱及酱油生产中米曲霉主要含中性蛋白酶和碱性蛋白酶,这两种蛋白酶主要是把原料中的蛋白质水解为肽类,而酸性蛋白酶则是一类肽酶,可将肽类分解成氨基酸。利用黑曲霉所含的酸性蛋白酶作为发酵酱油酶系的补充,是提高氨基酸含量的一条重要途径。黑曲酶还含有较高的谷氨酞胺酶,从而增强鲜味物质谷氨酸的生成,对于改善酱油风味起着一定作用。酱油生产中大豆蛋白降解主要是由于蛋白酶的作用,为了使大豆蛋白更好地降解,从而增加酱油风味,首先要在酱油酿造中提高蛋白酶活力,其次为了使大豆蛋白从组织中充分裸露,需要破坏原料细胞壁,纤维素酶能使细胞壁内包裹的蛋白质和淀粉质释放出来,以提高原料利用率。2.3纤维二糖和纤维寡糖的糖化作用纤维素酶是指能够水解纤维素β-1,4葡萄糖苷键的酶,使纤维素变成为纤维二糖和葡萄糖,微生物产生的纤维素酶是几种酶的混合物,包括Cl酶、Cx酶和β-1,4葡萄糖苷酶等,其中最重要的是C1酶和Cx酶。C1组分能将天然纤维素分解为直链纤维素,而Cx酶则是将直链纤维素内部切断,分解为纤维二糖和纤维寡糖,它也能将羧甲基纤维素分解为纤维二糖,β葡萄糖苷酶的作用则是将纤维二糖分解为葡萄糖。β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)是指能够水解芳香基或烷基葡萄糖甙或纤维二糖的糖苷键的一类酶。它可以催化水解结合于末端、非还原性的β-D-糖苷键,同时释放β-D-糖苷键和相应的配基,如芳基或烃基等。在纤维素的糖化作用中,β-葡萄糖苷酶将纤维二糖和纤维素寡糖水解成葡萄糖。近年来,人们对β-葡萄糖苷酶的研究表明,它可以水解糖苷键而将香味气体物质从结合态变成游离态,从而达到增香的目的,因此可作为一种风味酶。产生纤维素酶的微生物研究较多的是真菌,对细菌和放线菌研究很少。当前能够产生纤维素酶的微生物主要是木菌、黑曲霉、青霉和根霉,此外漆斑霉、反刍动物瘤胃菌、嗜纤维菌、产黄纤维单孢菌、侧孢菌、粘细菌、梭状芽孢杆菌等也能产生纤维素酶,同时纤维素酶具有对植物细胞壁的溶解破坏作用,使植物细胞中的内含物得到充分利用。2.4果胶系糖苷化果胶酶是分解果胶的酶的通称,也是一个多酶复合物,它通常包括原果胶酶、果胶甲酯水解酶、果胶酸酶三种酶。这三种酶的联合作用使果胶质得以完全分解。天然的果胶质在原果胶酶作用下,被转化成水可溶性的果胶;果胶被果胶甲酯水解酶(PE)催化去掉甲酯基,生成果胶酸;果胶酸酶切断果胶酸中的α-1,4-糖苷键,生成半乳糖醛酸,半乳糖醛酸进入糖代谢途径。果胶酶对果胶质起酯解、裂解、水解作用,产生半乳糖醛酸和寡聚半乳糖醛酸或不饱和的醛酸和寡聚半乳糖醛酸等物质,它们均含有一定量的醛基,具有一定的还原性。能产生果胶酶的菌种主要是霉菌,有文氏曲霉、苹果青霉、黑曲霉、白腐核菌、米曲霉、酵母等,此外,木质壳霉、芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、葡萄孢霉、镰刀霉也能产生果胶酶。2.5乳酸和丙酮酸亚基乳酸脱氢酶(LDH,EC1.1.1.27)能催化丙酮酸生成乳酸,同时使还原型辅酶Ⅰ(NADH)氧化生成辅酶Ⅱ(NAD)。乳酸脱氢酶是一种寡聚酶,由四个亚基组成,相对分子量大约为36000道尔顿,每一个亚基具有相同的功能,具有五种同工酶,其作用是催化乳酸和丙酮酸的可逆转化。反应中乳酸脱氢酶分子的每一个亚基都结合一个底物分子和一个辅酶分子(烟碱胺腺嘌呤二核苷酸NAD+/NADH),独立的发生反应。该酶属于胞内酶,随菌体破裂释放到细胞外。L-乳酸脱氢酶广泛存在于动、植物及微生物中,D-乳酸脱氢酶结构性质不同于L型,却与某些短链的脂肪酸脱氢酶具有同源性。在乳酸脱氢酶活力不高时,丙酮酸盐可以通过几个途径重新构建NADH,然后被代谢。这些过程给一些发酵食品带来了特殊风味。2.6乙醇脱氢酶系统结构及代谢特征乙醇脱氢酶(ADH)是指催化乙醇氧化为羰基化合物(乙醛)的酶,是具有立体专一性的含锌金属酶,使用NAD+(烟酸胺腺嘌呤二核苷酸)作为辅酶。乙醇脱氢酶在结合非蛋白组分(辅助因子cofactor)后,才表现出酶的活性。ADH的辅助因子是zn2+和NAD+。在催化反应中,乙醇脱氢酶决定酶反应的专一性,而辅酶因子则直接对电子、原子起传递作用。乙醇脱氢酶有两个结构域,其中一个是催化区域,它在结构中十分易变,另一个是结合核苷酸区域,形成多肽链折叠结构。辅酶是以一种类似伸展的敞开式的构象结合在酶上。纤维素、半纤维素水解产物中富含大量的糖类,包括葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖等混合糖,其中六碳糖较容易经微生物酵解生成乙醇。乙醇的发酵是不需要氧气的过程,酵母菌在无氧条件下,经EMP途径将葡萄糖分解产生丙酮酸,丙酮酸在脱羧酶的作用下脱羧生成乙醛,乙醛在乙醇脱氢酶作用下还原生成乙醇。细菌的乙醇发酵经过脱氧酮糖酸途径Entner-Doudorof(ED)途径。磷酸化的葡萄糖经ED途径产生丙酮酸,再经丙酮酸脱羧酶脱羧生成乙醛,继而在乙醇脱氢酶的作用下由NADH还原形成乙醇。有些细菌、酵母菌以及真菌也可代谢木糖产乙醇,同时还会产生2,3-丁二醇和各种有机酸等副产物。厌氧嗜热菌能直接利用纤维素和半纤维素生产乙醇、乳酸和乙酸。大肠杆菌(EscheriChiacoli)也可以代谢五碳糖和六碳糖。五碳糖的代谢主要是通过磷酸戊糖途径并与ED途径相偶联。六碳糖的代谢主要通过糖酵解途径完成。其代谢产物包括一些醛类、醇类、和有机酸,乙醇只是其中很小部分。2.7发酵过程中的色素形成的反应酚氧化酶包括多酚氧化酶,邻苯二酚氧化酶(EC1.10.3.1),酪氨酸酶(EC1.14.18.1),漆酶、对苯二酚氧化酶(EC1.10.3.2),还有过氧化物酶(EC1.11.1.7)。多酚氧化酶(Polyphenoloxidase,PPO)是植物体内普遍存在的一种非线粒体内的末端氧化酶。它可以把酚类物质如单酚、邻苯二酚、邻苯三酚、对苯二酚等氧化为相应的醌类物质,醌聚合并与细胞内蛋白质的氨基酸反应,结果发生黑色素沉淀,进而影响食品的色泽及其品质。多酚氧化酶和多酚类物质接触反应为:酱颜色的深浅是由它所含色素的多少来决定的,色素的形成主要来自三个方面:一是酱中的酪氨酸受微生物多酚氧化酶的催化,氧化聚合成的黑色素;二是酱中的糖分与氨基酸或蛋白质经过一种化学反应(美拉德反应)聚合成的类黑素.三是糖分经过加热变成的焦糖。由此可知褐变反应可分为非酶褐变及酶促褐变。非酶褐变包括氧化,焦糖化,美拉德反应。酱色50%～60%是由发酵过程产生的,其余由美拉德反应形成。多酚氧化酶易受一些因素的影响如Na2SO3、NaCl能抑制酶活力,因此酱醅中该酶活力较高,尤其是最初的3天内,酱醪发酵过程中,添加盐水降低该酶的活力,而美拉德反应却自始至终都伴随着。在酱油的酿造过程中大豆蛋白质的水解产物酪氨酸在氧气充分的条件下,通过多酚氧化酶的作用,发生酶促氧化缩合反应生成黑色素。所产生的色泽比非酶褐变深而黑,一般在制醪后期比较明显。该反应比较复杂,反应机理大致如下:①原料水解生成的酪氨酸在酚羟基酶作用下进行羟基化反应,形成3,4-二羟基苯丙氨酸;②3.4-二羟基苯丙氨酸在多酚氧化酶作用下生成邻-二醌基苯丙氨酸;③邻-二醌基苯丙氨酸经分子重排及聚合反应形成黑色素。2.8酯酶la-co-3.1.3酯酶(EsteraseE.C.3.1.1.2)亦称羧基酯酶,是指可以水解羧酯键的酶。但该酶也能催化合成低级脂肪酸酯。由于该酶既能催化酯的合成,也能催化酯的分解,因此习惯分别称为酯化酶和酯分解酶。酵母、霉菌、细菌中均含有酯酶。目前已经发现,红曲霉、根霉中许多菌株有较强的己酸乙酯合成能力。脂肪酶不同于酯酶。脂肪酶(Lipase,E.C.3.1.1.3)是一类特殊的酯酶,全称Triacylglycerolacylhydrolase。脂肪酶的正式名称是甘油酯水解酶。它既能将脂肪水解为脂肪酸和甘油,又能催化脂肪的合成。脂肪酶是可以水解一类特殊的酯类——三羧酸甘油酯的酶,而酯酶则是可以水解羧酯键的。许多微生物和高等真核生物都可产脂肪酶,其中有细菌、真菌、酵母和放线菌,主要有假丝酵母、园酵母、黑曲霉、根霉、白腐核菌、白地霉、青霉、毛霉、镰刀霉及假单孢菌、无色杆菌、葡萄球菌等。2.9+3豆酱原料氨基酸的形成谷氨酰胺酶(EC3.5.1.2)是控制发酵食品(如豆酱)风味的一种关键酶,它能分解谷氨酰胺生成谷氨酸和氨。谷氨酰胺酶是胞内酶,只有在自溶后才能发挥作用。谷氨酰胺酶催化的反应为:C5H9O3N2+H2O→EC5H8O4N+NH3C5Η9Ο3Ν2+Η2Ο→EC5Η8Ο4Ν+ΝΗ3豆酱原料中含有的谷氨酸有46%是作为谷氨酰胺存在的,谷氨酰胺是没有鲜味的,必需经过谷氨酰胺酶催化水解形成谷氨酸后,才呈鲜味。谷氨酸的形成要经过两步发酵过程:首先是原料经过蛋白酶和肽酶作用水解,然后是谷氨酰胺酶催化释放出游离的谷氨酸。谷氨酰胺酶对食盐很敏感,发酵中高浓度的食盐会抑制该酶的活性,KazuakiYoshimune等人将MicrococcusluteusK-3进行X射线诱变,产生的该酶具有较高的耐盐能力。有人研究了日本某酱油厂所使用的种曲,分离出一株曲霉菌,将它与我国酱油厂普遍使用的A3.042米曲霉按常法进行酿造对比试验,发现两者酿造出来的成品酱油氨基氮含量差不多,但前者酿出的酱油比用后者酿出的鲜味浓,经分析前者谷氨酸含量为22.82g/L,后者仅为10.47g/L。因此,在酿造酱油时应考虑提高菌种中谷氨酰胺酶的活性或添加谷氨酰胺酶。3酱油发酵过程中的酶制剂研究取得了大成曲的发展我国酱生产中多数企业单一使用沪酿3042米曲霉菌种,该菌种产生的主要是中性蛋白酶,而淀粉酶、酸性蛋白酶;纤维素酶等活性较低,影响了原料中蛋白质和淀粉质的利用以及风味物质的产生,因此技术力量强的企业已逐步使用多菌种发酵工艺以提高原料利用率和改善酱油风味。一些中小型企业通过添加酶制剂来使酶的配比合理化,丰富和强化酱油成曲中酶系,也是一个有效途径。为了让酶制剂在酱油酿造中更好地应用,酿造科技工作者做了大量研究开发应用工作,并取得很大进展。日本从1964年筛选出